隨著海水養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大和養(yǎng)殖環(huán)境的持續(xù)惡化，養(yǎng)殖動物細(xì)菌性疾病呈暴發(fā)性流行，已成為制約全球海水養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展的重要因素，嚴(yán)重影響著海水養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。其中弧菌病是海水動物養(yǎng)殖中危害最為嚴(yán)重的病害之一。哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)具有毒性大、耐藥性強(qiáng)、可侵染多種宿主的特點(diǎn)，已成為華南地區(qū)海水養(yǎng)殖最嚴(yán)重的細(xì)菌性病原之一。為防治疾病，多采用抗生素和化學(xué)藥品控制弧菌病，結(jié)果不僅使養(yǎng)殖水體的正常菌群遭到破壞，還導(dǎo)致病原菌株的耐藥性增強(qiáng)，嚴(yán)重污染近岸海域生態(tài)環(huán)境。因此，建立哈維氏弧菌病原的生態(tài)防控技術(shù)是當(dāng)前確保我國華南地區(qū)海水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的必由之路。
利用微生物間的拮抗作用開展生物防治，是防控水產(chǎn)細(xì)菌性病原的重要有效途徑。目前應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖上的拮抗菌制劑主要有兩大類：(1)單一制劑，如熒光假單胞菌(Pseudomonnasfluorescens)、中間氣單胞菌(Aerommasmedia)、芽孢桿菌(Bacillus)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、乳酸菌、乳酸桿菌(Lactobacillus)、溶藻膠弧菌(V.alginolyticus)、光合細(xì)菌、蛭弧菌(Bdellovibriobacteriovorus)等；(2)復(fù)合益生菌制劑，如美軍方、復(fù)合型活性生物凈水劑等，這類益生菌主要由硝化和反硝化假單胞菌、乳酸桿菌、酵母菌、雙歧桿菌、反硝化細(xì)菌、枯草桿菌等菌株組成。
近年來，自海南文昌地區(qū)中分離出的假交替單胞菌(Pseudoalteromonassp.)WCPW15003對哈維氏弧菌的拮抗作用最為明顯，但該菌在2216E培養(yǎng)基中的最高培養(yǎng)密度僅108cfu/mL，且針對不同密度弧菌病原的具體使用密度也未確定，難以實(shí)現(xiàn)規(guī)?；囵B(yǎng)和應(yīng)用。筆者將以2216E培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，通過額外補(bǔ)充一定含量的碳源和氮源，優(yōu)化假交替單胞菌WCPW15003的培養(yǎng)基組分；同時(shí)，確定不同密度弧菌病原所需要的最低拮抗菌密度，其結(jié)果將為今后開發(fā)防治熱帶海水養(yǎng)殖哈維氏弧菌病原的益生菌制劑及其施用技術(shù)奠定良好基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1菌株
假交替單胞菌WCPW15003，分離自海南文昌水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)底泥樣品(深80 cm)；哈維氏弧菌PBVH3311分離自海南臨高某對蝦養(yǎng)殖基地。以上2株菌種保存于本實(shí)驗(yàn)室。
1.2方法
1.2.1菌種活化
取保藏于-80℃冰箱中的哈維氏弧菌PBVH3311和假交替單胞菌WCPW15003，接種于2216E液體培養(yǎng)基中，30℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。
1.2.2活菌計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測定
取10 mL活化后的假交替單胞菌WCPW15003菌懸液或哈維氏弧菌PBVH3311菌懸液，4000 r/min離心5 min，移除上清液，重懸于PBS溶液；進(jìn)行二倍倍比稀釋，稀釋5個密度梯度，分別測菌懸液吸光值。將各稀釋梯度吸光值與其對應(yīng)稀釋倍數(shù)進(jìn)行線性相關(guān)分析，要求r2>0.98。采用平板計(jì)數(shù)法檢測相應(yīng)菌液中的活菌密度(cfu/mL)。根據(jù)菌懸液吸光值和活菌密度，繪制其活菌計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.2.3生長曲線測定
使用Bioscreen C全自動生長曲線分析儀測定假交替單胞菌WCPW15003和哈維氏弧菌PBVH3311的生長曲線。操作如下：加350μL的2216E液體培養(yǎng)基至蜂窩板，分別接種活化的假交替單胞菌WCPW15003菌懸液和哈維氏弧菌PBVH3311菌懸液各50μL，充分吸打混勻，于30℃下，180 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，每小時(shí)檢測1次吸光值，檢測波長為600 nm。設(shè)置3個平行組。
1.2.4培養(yǎng)基優(yōu)化
以2216E培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其組分為：胰蛋白胨(5 g/L)、酵母提取物(1 g/L)、磷酸鐵(0.01 g/L)，通過補(bǔ)加一定量的牛肉膏或(和)紅糖，組成假交替單胞菌培養(yǎng)基A、B、C(試驗(yàn)組)(表1)。每組設(shè)置3個平行。
表1假交替單胞菌培養(yǎng)基
注：“+”表示添加，“-”表示不添加.
接種1%(體積比)活化后的假交替單胞菌WCPW15003菌懸液(密度為3×108cfu/mL)，振蕩培養(yǎng)(30℃，180 r/min)至對數(shù)生長晚期。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)數(shù)法，確定各組菌懸液密度。采用SPSS 18.0軟件對組間數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和Duncan多重比較，統(tǒng)計(jì)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P<0.05表示差異顯著，以P<0.01表示差異極顯著。
1.2.5拮抗試驗(yàn)
將活化的哈維氏弧菌PBVH3311菌懸液稀釋后加入2216E半固體培養(yǎng)基(pH 7.6、鹽度30)中，制作成病原菌平板。病原菌平板密度設(shè)置為101～108cfu/mL共8個10倍倍比稀釋密度。采用瓊脂擴(kuò)散法測定101～109cfu/mL共9個10倍倍比稀釋的假交替單胞菌WCPW15003菌懸液的拮抗作用效果，打孔直徑為5.98 mm。培養(yǎng)溫度為30℃，正置培養(yǎng)24 h，用數(shù)顯游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑(精確到mm)。設(shè)置3個平行組。采用Matlab軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，擬合多元二次回歸方程。
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