1.6.2乙醚敏感性試驗
取2 mL病毒液與0.5 mL乙醚混勻置4℃過夜，次日900×g離心30 min，吸取下層病毒液并過濾除菌，于MDBK細(xì)胞中測定TCID50。
1.6.3氯仿敏感性試驗
病毒液以2400×g離心30 min去除細(xì)胞碎片，取1.2 mL上清與200μL氯仿混勻置4℃過夜，次日取上層病毒液并過濾除菌，于MDBK細(xì)胞中測定TCID50。
1.6.4胰蛋白酶敏感性試驗
取1 mL病毒液與等體積0.5%胰蛋白酶溶液混勻（胰蛋白酶終濃度為0.25%），置37℃作用1 h，立即加入4 mL胎牛血清以終止胰蛋白酶的作用，過濾除菌后于MDBK細(xì)胞中測定TCID50。
1.6.5耐酸耐堿性試驗
分別取2 mL病毒液，將其pH調(diào)至3.0、5.0、9.0和10.0，置于37℃水浴中作用1 h，再將pH調(diào)至7.0，過濾除菌后于MDBK細(xì)胞中測定TCID50。
1.6.6溫度敏感性試驗
各取1 mL病毒液，分別置于50℃和56℃水浴中作用30 min。各取1 mL病毒液與等體積MgSO4（終濃度1 mol/L）混勻，分別置于50℃、56℃水浴中作用30 min。處理后的病毒液均于MDBK細(xì)胞中測定TCID50。
1.7病毒的細(xì)胞嗜性
將分離的病毒NM575株分別接種于MDBK、BHK-21、PK-15、MDCK、Vero-E6、CEF、Marc145等細(xì)胞中，逐日觀察，出現(xiàn)CPE及時收毒。收獲的病毒液于MDBK細(xì)胞中測定TCID50。
1.8病毒一步生長曲線
將分離毒株NM575按100 TCID50/0.1 mL分別接種于MDBK細(xì)胞6小瓶，吸附1 h。用PBS洗去未吸附的病毒，加入維持液，于5%CO2、37℃培養(yǎng)。分別于接毒后3、6、12、24、36、48 h收毒，收獲的病毒液于MDBK細(xì)胞中測定TCID50，繪制生長曲線。
1.9 RT-PCR檢測
參考GenBank中登錄的牛腸道病毒BJ001株（HQ663846）全基因組序列，設(shè)計并合成特異性擴(kuò)增P1基因的引物，引物序列為：P1F：5'-C C A A C T G A A C C T G G C G T A T-3'，P 1 R：5'-GACTGTAGCCCGAAATCCC-3'。預(yù)期擴(kuò)增片段大小為1338 bp。
按照AXYGEN病毒RNA小量提取試劑盒方法提取病毒基因組RNA。用下游引物作為反轉(zhuǎn)錄引物將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA為模板，進(jìn)行P1基因的擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，50℃退火45 s，72℃延伸3 min，共30個循環(huán)；72℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。將擴(kuò)增片段進(jìn)行膠回收，與PMD-18T載體連接，并轉(zhuǎn)入感受態(tài)DH5α中，經(jīng)培養(yǎng)后挑取單個菌落，搖菌后送吉林庫美公司測序。測序結(jié)果與GenBank中登錄的BEV參考毒株序列進(jìn)行比較，利用MAGE6軟件進(jìn)行同源性分析，并繪制遺傳進(jìn)化樹。
2結(jié)果
2.1病毒的分離結(jié)果
30份鼻拭子接種MDBK細(xì)胞后，第1代有1個樣品出現(xiàn)CPE，表現(xiàn)為細(xì)胞圓縮集聚并突出于底層細(xì)胞表面，隨著時間的推移，細(xì)胞破裂。進(jìn)行病毒分離，獲得的毒株命名為NM575。其他樣品盲傳后未見CPE。對照組細(xì)胞生長良好（圖1）。
圖1病毒分離株NM575在MDBK中引起的細(xì)胞病變
2.2電鏡觀察結(jié)果
病毒分離株NM575接種MDBK細(xì)胞的上清，經(jīng)電鏡負(fù)染可觀察到無囊膜的球形病毒粒子，直徑大小約30 nm，與小RNA病毒粒子的特征相符（圖2）。
圖2分離株NM575病毒粒子電鏡圖
2.3病毒的理化特性
100μg/mL的DNA抑制劑5-溴脫氧尿苷（BRDU）不能抑制分離株NM575的增殖，能夠抑制DNA病毒IBRV，不能抑制R N A病毒B P I V 3，且對M D B K細(xì)胞無毒性，由此可判定該毒株為R N A病毒。分離株N M 5 7 5細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)乙醚、氯仿及胰蛋白酶處理后，TCID50與對照組比較無明顯差異，表明分離病毒對脂溶劑及胰蛋白酶有一定的抵抗能力。耐酸耐堿試驗結(jié)果顯示，該病毒可抵抗pH3.0的酸性環(huán)境，但對pH9.0的堿性環(huán)境敏感。50℃30 min可使該病毒活性明顯下降，56℃30 min可使病毒失活，表明該病毒對熱敏感。在病毒培養(yǎng)物中加入終濃度為1 mol/L MgSO4后，經(jīng)50℃或56℃30 min作用后其TCID50無明顯變化，說明二價陽離子（如Mg2+）可提高分離病毒對高溫環(huán)境的抵抗力（圖3）。
圖3分離病毒株NM575理化特性鑒定結(jié)果
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