1.2植物和細(xì)菌培養(yǎng)
將番茄種子于55℃水浴中浸泡催芽，待種子出芽之后播種至穴盤中，將草炭∶蛭石∶珍珠巖以3∶1∶1的比例均勻混合為培養(yǎng)基質(zhì)。將穴盤放于恒溫光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：25℃恒溫光照12 h，18℃恒溫黑暗12 h。待幼苗長至2葉1心后，移苗至盆中放于恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。幼苗長至5葉1心后選取長勢相當(dāng)?shù)慕】抵仓暧糜谠囼灐?
將Pto接種至含有利福平（50μg/mL）的KB固體培養(yǎng)基中；將cor-接種至含有卡那霉素（100μg/mL）和利福平（50μg/mL）的KB固體培養(yǎng)基中。平板倒置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)14～16 h。
1.3番茄葉片的COR處理
將COR溶解配置為1μmol/L（高濃度）、0.1μmol/L（較高濃度）、0.01μmol/L（較低濃度）、0.001μmol/L（低濃度）4個濃度的COR溶液，選取第3、4片復(fù)葉中較大的5片小葉進(jìn)行處理，用1 mL無菌注射器（去注射器針頭）將不同濃度COR溶液注射進(jìn)番茄葉片中，每片小葉注射溶液量約為1 mL，以去離子水作為對照組，每個組至少處理15片小葉。24 h后取樣，用液氮速凍葉片之后存放于-80℃冰箱中用于后續(xù)實驗。
1.4基因表達(dá)差異分析
將COR處理后的番茄葉片于液氮中研磨至粉末狀，取100 mg混合均勻的樣品，采用Trizol法提取總RNA。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。利用Primer 5設(shè)計7對引物（表1），測定不同處理下葉片中的PR1a、LoxD、MYC2、EIN2、EIN3和PAL5基因的相對表達(dá)量，以番茄Actin基因作為內(nèi)參基因。在CFX96實時熒光定量分析儀（Bio-Rad上海有限公司）上進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性30 s，反應(yīng)循環(huán)“95℃變性5 s，60℃退火延伸30 s”，共設(shè)置40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算基因相對表達(dá)量。本次試驗設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。
1.5細(xì)菌生長能力測定
用10 mmol/L MgCl2溶液將KB固體培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)的細(xì)菌菌落重懸，稀釋菌液直至OD600=0.2。將OD600=0.2的菌液（濃度為1×108CFU/mL）稀釋1 000倍，用1 mL無菌注射器注射菌液到葉片中，每片小葉注射菌液量約為1 mL，72 h后用打孔器隨機(jī)在接種過細(xì)菌的葉片上打孔取樣，每個處理取9個葉圓片，用研磨儀研磨葉片，梯度稀釋菌液之后取10μL菌液滴于KB固體培養(yǎng)基上，待菌液自然揮發(fā)之后倒置于28℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)48 h。選取CFU（Colony-Forming Units）在20～100范圍內(nèi)的梯度進(jìn)行計數(shù)，每個梯度至少3次計數(shù)后取平均值計數(shù)。本實驗設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。
1.6胼胝質(zhì)沉積分析
用1 mL無菌注射器注射OD600=0.2的菌液到葉片中，每片小葉注射菌液量約為1 mL，以10 mmol/LMgCl2溶液作為對照。以水∶甘油∶苯酚∶乳酸∶乙醇=1∶1∶1∶1∶2的體積比配置脫色液，胼胝質(zhì)是一種相對較晚的植物防御指標(biāo)，在接種細(xì)菌到葉片15 h后能夠在葉片中被觀測到，我們將處理15 h后的葉片浸沒在脫色液中過夜脫色。用去離子水和50%乙醇交替沖洗葉片3次，采用0.01%水溶性苯胺藍(lán)將葉片胼胝質(zhì)染色，染色時間為30 min。染色結(jié)束后用去離子水洗去葉片上的染液，移到載玻片后制成葉片標(biāo)本放于熒光顯微鏡紫外波長下觀察，保存圖像。采用Image J軟件統(tǒng)計胼胝質(zhì)沉積數(shù)量。每個處理組取至少取5片葉片進(jìn)行觀察，每片葉片至少選取3個不同視野區(qū)域進(jìn)行統(tǒng)計。本實驗設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。
表1 RT-qPCR分析引物
1.7數(shù)據(jù)處理
使用IBM SPSS Statistic 20進(jìn)行差異顯著分析，采用Excel軟件繪圖。
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