2結(jié)果
2.1細(xì)胞裂解上清Westernblot分析結(jié)果顯示，SiHa/M、SiHa/R組在4～6 Ku區(qū)域出現(xiàn)目的條帶，而SiHa組無(wú)目的條帶(圖1)。
圖1細(xì)胞裂解上清的Western blot分析
2.2mBD2對(duì)細(xì)胞活力的影響第1天SiHa/M、SiHa/R組與SiHa組比較，細(xì)胞活力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.091)；第2、3天SiHa/M、SiHa/R組細(xì)胞活力明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.018)；第4、5天3組細(xì)胞活力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.374)(圖2)。
2.3mBD2對(duì)細(xì)胞凋亡的影響
2.3.1 AnnexinⅤ聯(lián)合PI檢測(cè)結(jié)果結(jié)果顯示SiHa/M、SiHa/R及SiHa組AnnexinⅤ+/PI+雙陽(yáng)性細(xì)胞的百分率分別為2.4%、2.3%、2.3%，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.743)；AnnexinⅤ+/PI-細(xì)胞分別為0.9%、1.2%、1.5%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)。
圖2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞活力分析結(jié)果
2.3.2 TUNEL檢測(cè)結(jié)果細(xì)胞大小形態(tài)不一，可見凋亡細(xì)胞胞核固縮濃染，核質(zhì)致密，出現(xiàn)核邊緣化，呈半月形；正常細(xì)胞胞核相對(duì)疏松，無(wú)核濃染現(xiàn)象(圖4～6)。SiHa/M、SiHa/R組凋亡細(xì)胞發(fā)生率較高，分別為(40.6±4.67)%、(30.2±3.19)%，而SiHa組只有(7.4±1.94)%，SiHa/M、SiHa/R組凋亡細(xì)胞發(fā)生率明顯高于SiHa組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004)；SiHa/M組與SiHa/R組比較，SiHa/M組凋亡發(fā)生率高于SiHa/R組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003)。
3討論
機(jī)體對(duì)“非己”的免疫反應(yīng)需要天然免疫和獲得性免疫系統(tǒng)的協(xié)同作用。天然免疫反應(yīng)不僅提供了抵抗微生物的第一道防線，同時(shí)也包含指導(dǎo)獲得性免疫所必需的“危險(xiǎn)信號(hào)”。防御素是宿主執(zhí)行免疫防御能力的細(xì)胞所分泌的、具有殺微生物活性和細(xì)胞毒性的小分子多肽，提供直接、即刻的抗微生物效應(yīng)以保護(hù)宿主免受入侵病原微生物損害，是固有免疫中重要的效應(yīng)分子和調(diào)節(jié)分子，廣泛用于抗菌、抗病毒等作用的研究。自首次報(bào)道防御素能裂解腫瘤細(xì)胞之后，不斷有研究提示防御素與腫瘤免疫有關(guān)。研究表明，mBD2可與細(xì)胞表面CCR6受體結(jié)合，呈劑量依賴性的誘導(dǎo)未成熟樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)CD34+祖細(xì)胞源性DCs的移動(dòng)。進(jìn)一步的研究顯示，mBD2可與Toll樣受體4(toll like receptor，TLR)結(jié)合，誘導(dǎo)骨髓源性DCs成熟。此外，由于腫瘤細(xì)胞膜表面特性發(fā)生改變而使得防御素能夠與之結(jié)合并產(chǎn)生抗瘤作用也可能是防御素抗腫瘤的機(jī)制之一。防御素對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用遠(yuǎn)大于非腫瘤細(xì)胞，但這種選擇性殺傷的機(jī)制目前尚不清楚。
本研究通過細(xì)胞活力測(cè)定，顯示SiHa/M、SiHa/R組細(xì)胞在貼壁后2～3 d細(xì)胞活性明顯低于正常SiHa細(xì)胞。隨后，隨著細(xì)胞數(shù)目增加，培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗增加，細(xì)胞代謝產(chǎn)物堆積，細(xì)胞活性開始下降，提示mBD2蛋白對(duì)細(xì)胞活力有一定的抑制作用。這可能與防御素作用于細(xì)胞線粒體從而影響腫瘤細(xì)胞呼吸、導(dǎo)致細(xì)胞代謝紊亂、細(xì)胞活力下降有關(guān)。SiHa/M、SiHa/R組細(xì)胞活力比較，SiHa/M始終低于SiHa/R組，但兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明2種蛋白信號(hào)肽分子對(duì)蛋白活性影響不大。
本研究采用Annexin V聯(lián)合PI法和TUNEL 2種方法測(cè)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的凋亡情況。2種方法分別檢測(cè)凋亡發(fā)生的不同時(shí)相，反映誘發(fā)凋亡的不同機(jī)制。采用AnnexinⅤ檢測(cè)方法觀察細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)3組細(xì)胞凋亡指數(shù)無(wú)明顯差別；采用TUNEL染色，結(jié)果顯示SiHa/M、SiHa/R組凋亡細(xì)胞發(fā)生率較高，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；SiHa/M組與SiHa/R組比較，SiHa/M組凋亡發(fā)生率高于SiHa/R組。
綜上所述，可以認(rèn)為mBD2蛋白所誘導(dǎo)的SiHa細(xì)胞凋亡主要以腫瘤細(xì)胞DNA出現(xiàn)斷裂損傷為主，這與Hariton等研究結(jié)果一致。而由于細(xì)胞膜損傷導(dǎo)致PS外翻通過AnnexinⅤ檢測(cè)方法未能得到驗(yàn)證，可能是由于早期凋亡所產(chǎn)生的PS外翻過程較為短暫，采用AnnexinⅤ未能捕捉到早期凋亡信號(hào)，故檢測(cè)陽(yáng)性率較低。由于SiHa/M與SiHa/R的主要區(qū)別在于兩者所轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒中插入序列信號(hào)肽區(qū)域基因有所不同，是否信號(hào)肽及其調(diào)控區(qū)序列在成熟肽形成中具有一定的調(diào)節(jié)功能，從而對(duì)成熟肽功能產(chǎn)生一定影響，還需實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究證實(shí)。
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