小麥?zhǔn)侨蚍植挤秶顝V的糧食作物，其產(chǎn)量和種植面積均居世界谷物的首位。小麥產(chǎn)量與其生長狀況有關(guān)，其生長過程中易受到多種病害的危害，導(dǎo)致產(chǎn)量降低或品質(zhì)變差，其中土傳病害尤為嚴(yán)重。麥根腐平臍孺孢(Bipolarissorokiniana)是一種能夠侵染小麥的重要土傳病原菌，該病菌引發(fā)的病害在小麥整個生育期均可發(fā)生，通常表現(xiàn)為種子發(fā)芽率低、根腐病、莖基腐病、葉斑病和穗腐病等癥狀，導(dǎo)致小麥大幅減產(chǎn)，嚴(yán)重時減產(chǎn)超過50%。小麥根腐病在中國北部地區(qū)比較普遍，近年來在廣東、福建等小麥種植區(qū)也有發(fā)現(xiàn)，對小麥安全生產(chǎn)造成嚴(yán)重威脅。
目前，小麥根腐病的防治主要以化學(xué)藥劑處理種子為主，以農(nóng)田作物輪作、篩選抗病品種、生物防治等為輔?；瘜W(xué)藥劑處理種子能夠有效降低病害發(fā)生幾率，但長期不合理使用不僅導(dǎo)致病原菌對藥劑產(chǎn)生抗性，破壞土壤微生物群落平衡，也造成了環(huán)境污染。農(nóng)田作物輪作與種植區(qū)域有關(guān)，利用水旱輪作可有效降低土壤中有害病原菌的存活率。利用抗病品種防治小麥根腐病，經(jīng)濟(jì)安全，但選育工作時間不僅長，而且在種植過程中植株的抗病能力普遍較差。生物防治對于降低病菌數(shù)量、恢復(fù)土壤健康有重要實踐意義，但土壤自然環(huán)境多變，病菌種類多樣，生防微生物定殖能力差，且生防菌具有定向性，難以大規(guī)模使用。因而，小麥根腐病防治仍是一個亟待解決的難題。
近幾年，隨著納米技術(shù)的發(fā)展，納米抗菌材料應(yīng)運(yùn)而生。與傳統(tǒng)化學(xué)藥劑相比，納米材料具有安全、高效、廣譜、不易產(chǎn)生抗藥性等特點，已成為當(dāng)前領(lǐng)域的研究熱點。已有研究表明，納米銀對多種細(xì)菌、真菌和支原體具有強(qiáng)烈的抑制作用，是一種良好的無機(jī)抗菌材料。Mishra等采用生物法合成的納米銀粒子能夠抑制小麥葉片上小麥根腐菌分生孢子的萌發(fā)，降低小麥植株感染葉斑病的幾率。Mishra和Singh研究發(fā)現(xiàn)，納米銀在低濃度時顯著抑制小麥根腐菌菌絲的生長。李琴琴等采用化學(xué)還原法制備的納米銀能夠破壞小麥赤霉病菌完整性，抑制病菌生長。Ali等采用苦艾水提取物合成納米銀材料對引發(fā)植物病害的六種寄生疫霉菌具有抗疫能力，能夠提高植物存活率。2016年陳娟妮等采用靜電自組裝法合成石墨烯-納米銀材料，4.68μg·mL-1的濃度就能夠抑制禾谷鐮刀菌分生孢子萌發(fā)，抑制離體葉片上病斑的發(fā)展。這些研究結(jié)果表明，納米銀對植物病原菌分生孢子萌發(fā)和菌絲生長具有顯著抑制作用，但是關(guān)于納米銀對病菌侵染下植物生長影響的研究尚不多見。
本研究以楊樹葉為生物模板制備納米ZnO-Ag復(fù)合材料，探究ZnO-Ag對根腐病菌菌殺菌活性，通過盆栽試驗，在土壤接種小麥根腐菌情況下，測定納米ZnO-Ag復(fù)合材料對小麥種子萌發(fā)和幼苗生長的影響，旨在為小麥根腐病的田間防治提供參考，為ZnO-Ag的應(yīng)用提供理論依據(jù)。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1供試菌株和培養(yǎng)基
本研究所用麥根腐離孺孢菌(B.sorokiniana)，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所作物遺傳育種中心提供。PDA固體培養(yǎng)基：稱取馬鈴薯200 g，洗凈去皮切碎，加水1 000 mL煮沸30 min，趁熱過濾后加入葡萄糖20 g，瓊脂20 g，定容至1 000 mL，121℃滅菌30 min，備用。
1.1.2供試小麥和土壤
供試的京東8號小麥由河北科技師范學(xué)院植物生理與生物技術(shù)實驗室提供。播種前種子用3%H2O2浸泡10 min，無菌水清洗3次。將種子浸泡于無菌水中，12 h后選取顆粒飽滿種子，備用。供試土壤取自河北科技師范學(xué)院試驗田，土壤置于高壓蒸汽滅菌鍋中121℃，滅菌1 h，殺滅可能存在的微生物和孢子，晾干備用。重復(fù)3次，盆缽為塑料盆，上口內(nèi)徑9 cm，盆底內(nèi)徑7 cm，高7.5 cm，于高壓蒸汽滅菌鍋中121℃，滅菌15 min，備用。
1.2方法
1.2.1納米ZnO-Ag復(fù)合材料的制備
采用生物模板法合成納米材料。以楊樹葉片為模板，將新鮮的楊樹葉片用去離子水清洗干凈，置于2%(v/v)戊二醛溶液中固定6 h。用去離子水清洗后，將葉片浸泡于2%(v/v)的鹽酸溶液中，12 h后去離子水清洗。將葉片置于100 mL溶有Zn(NO3)2(0.08 M)和AgNO3(0.06 M)的溶液中，60℃保溫72 h。將葉片水洗風(fēng)干，置于馬弗爐中500℃煅燒2 h，研碎即得。利用X-射線衍射(X-ray diffraction，XRD)和透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy，TEM)對材料成分和形貌進(jìn)行分析。
1.2.2小麥根腐菌的活化與培養(yǎng)
將保藏的小麥根腐菌菌液涂布于PDA固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)4～5 d，用打孔器取直徑為6 mm的菌餅轉(zhuǎn)接于新的PDA固體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)，待菌絲鋪滿平板后置于4℃冰箱保存，備用。
1.2.3納米ZnO-Ag復(fù)合材料對小麥根腐菌菌絲抑制效果的測定
采用菌絲生長速率法測定。具體步驟：無菌條件下，用滅菌的PAD培養(yǎng)基稀釋納米ZnO-Ag復(fù)合材料，終濃度分別為12.5、25、50、100、200μg·mL-1，以不加ZnO-Ag材料的培養(yǎng)基為對照。取生長一致直徑為6 mm的小麥根腐菌菌餅接種至上述平板中心，28℃靜置培養(yǎng)，每個處理重復(fù)3次。待對照菌落鋪滿平板時停止培養(yǎng)，沿平板直徑十字交叉法測量菌落直徑，計算菌絲生長抑制率。菌絲生長抑制率=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-0.6 cm)
1.2.4納米ZnO-Ag復(fù)合材料對小麥根腐病菌侵染下小麥幼苗生長效應(yīng)的測定
盆栽試驗參考張姍姍等研究方法，于2019年3月中旬在河北科技師范學(xué)院植物生理與生物技術(shù)實驗室實施。滅菌后盆缽中裝入供試土壤，每盆500 g。納米ZnO-Ag復(fù)合材料用無菌水稀釋，超聲處理30 min。每盆分次加入50 mL不同濃度的ZnO-Ag復(fù)合材料溶液，使土壤中材料終濃度分別為12.5、25、50、100、200μg·g-1，每個濃度5次重復(fù)，對照加入50 mL無菌水。將直徑為6 mm的小麥根腐菌餅分成4份均勻埋入土中，約5 cm深，28℃培養(yǎng)1周使病菌充分生長。之后每盆均勻播種小麥12粒，約3 cm深，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。光周期設(shè)置為白天14 h、22℃，夜晚10 h、18℃，相對濕度80%。每天使用無菌水灌溉，維持小麥正常生長。
1.2.5測定項目
小麥播種后第3天測定發(fā)芽勢，7 d測定發(fā)芽率。播種21 d后，將盆中所有幼苗連根拔出，洗凈，測定幼苗發(fā)病率，幼苗發(fā)病數(shù)是幼苗根部變褐、腐爛死亡的幼苗數(shù)和未萌發(fā)種子數(shù)之和。將幼苗以子葉著生部位為準(zhǔn)分開地上、地下部分，分別測量根長和株高，稱量鮮重后置于烘箱中85℃烘干至恒重，并計算根冠比。
發(fā)芽勢=前3 d發(fā)芽種子總數(shù)/供試種子粒數(shù)×100%
發(fā)芽率=7 d發(fā)芽種子粒數(shù)/供試種子粒數(shù)×100%
幼苗發(fā)病率=(未萌發(fā)種子數(shù)+發(fā)病幼苗數(shù))/供試種子數(shù)×100%
根冠比=地下部分干重/地上部分干重
1.3數(shù)據(jù)處理
采用Excel 2017進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和繪圖，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和LSD顯著性檢驗(P<0.05)。
2結(jié)果與分析
2.1納米ZnO-Ag復(fù)合材料的表征
利用生物模板法制得的納米ZnO-Ag復(fù)合材料呈黑色細(xì)粉狀。XRD分析圖譜(圖1A)顯示為尖銳峰，表示材料的結(jié)晶度較好。圖1A標(biāo)注*的為ZnO衍射峰，2θ值在31.68°、34.32°、36.16°、47.44°、56.50°、62.76°和67.86°處，與標(biāo)準(zhǔn)卡(JCPDS No.36-1451)上(100)、(002)、(101)、(102)、(110)、(103)和(112)晶面所對應(yīng)的2θ值基本一致。圖1A標(biāo)注#的光譜2θ值，從小到大依次對應(yīng)Ag的四個晶面(111)、(200)、(220)和(311)，這與Ag的標(biāo)準(zhǔn)圖譜卡片(JCPDS No.04-0783)相吻合。TEM結(jié)果(圖1B)表明，該材料為近圓形的納米層狀結(jié)構(gòu)，平均顆粒直徑為30～50 nm。高分辨透射電子顯微成像(high-resolution transmission electron microscopy，HRTEM)結(jié)果表明，晶格間距為0.26 nm對應(yīng)ZnO的(002)晶面，晶格間距為0.23 nm對應(yīng)Ag的(111)晶面，由此可進(jìn)一步確定，本材料為ZnO與Ag的復(fù)合體。
圖1納米ZnO-Ag復(fù)合材料的XRD衍射花樣(A)、TEM圖(B)和HRTEM圖(C)
2.2納米ZnO-Ag復(fù)合材料的抑菌效果
由表1可知，納米ZnO-Ag復(fù)合材料能夠抑制小麥根腐菌菌絲的生長，菌絲生長抑制率隨材料濃度的升高而增大，200μg·mL-1ZnO-Ag對病菌菌絲生長抑制率高達(dá)91.17%；不同濃度復(fù)合材料處理的病菌菌絲生長抑制率間差異均顯著(P<0.05)。納米ZnO-Ag對病菌的毒力回歸方程為y=2.581 8+1.577 1x，EC50=34.15μg·mL-1，說明ZnO-Ag復(fù)合材料對小麥根腐病菌的抑制作用較強(qiáng)。
表1納米ZnO-Ag復(fù)合材料對小麥根腐菌菌絲生長影響
2.3納米ZnO-Ag復(fù)合材料對根腐病菌侵染下小麥種子萌發(fā)的影響
由表2可知，隨著土壤中納米ZnO-Ag復(fù)合材料濃度增加，小麥種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率均逐漸升高。12.5μg·g-1ZnO-Ag處理的小麥種子發(fā)芽勢與對照無顯著差異，其他濃度處理組發(fā)芽勢顯著升高(P<0.05)。200μg·g-1ZnO-Ag處理的小麥種子發(fā)芽勢顯著高于12.5、25、50μg·g-1處理組，與100μg·g-1處理組無顯著差異，而ZnO-Ag濃度為25、50、100μg·g-1處理間小麥種子發(fā)芽勢無顯著差異。不同濃度ZnO-Ag處理的小麥種子發(fā)芽率均顯著高于對照。12.5μg·g-1ZnO-Ag處理的小麥發(fā)芽率顯著低于其他濃度處理，濃度為25、50、100、200μg·g-1處理間發(fā)芽率無顯著差異。
表2納米ZnO-Ag復(fù)合材料處理對小麥種子萌發(fā)的影響
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