研究背景：叢枝菌根真菌（AMF）是關(guān)鍵的土壤生物，其廣泛的菌絲創(chuàng)造了一個(gè)與積極參與氮循環(huán)的微生物相關(guān)的獨(dú)特菌絲圈。然而，AMF和菌絲相關(guān)微生物如何合作影響N2O的潛在機(jī)制“熱點(diǎn)”殘留斑塊的排放仍不清楚。在這里，我們探索了菌絲層中涉及N2O的關(guān)鍵微生物使用擴(kuò)增子和霰彈槍宏基因組測(cè)序。使用體外培養(yǎng)和接種實(shí)驗(yàn)測(cè)試了分離的N2O還原細(xì)菌對(duì)菌絲分泌物的趨化性、生長和N2O排放。
研究簡介：一氧化二氮（N2O）是一種非常強(qiáng)大且壽命長的溫室氣體，其全球變暖潛能值是CO2的273倍并且是大氣中存在的最重要的臭氧消耗物質(zhì)。然而，限制全球大氣N2O預(yù)算仍然具有挑戰(zhàn)性，因?yàn)镹2O土壤-大氣界面處的通量是高度動(dòng)態(tài)和可變的，其特征是微觀尺度上的“熱點(diǎn)”和“熱矩”，通常<1 cm3在數(shù)量上，與農(nóng)業(yè)中的作物殘茬斑塊相關(guān)。估計(jì)值N2O作物秸稈的排放因子變化很大，從0.17%到2.9%不等，這取決于殘留物特性和多種環(huán)境因素，如C/N比、土壤類型、充水孔隙空間（WFPS）和溫度。N2O的高時(shí)空動(dòng)力學(xué)通量是由于N2O背后的復(fù)雜微生物過程生產(chǎn)和消費(fèi)，以及它們?nèi)绾问艿狡渌锖头巧镆蛩氐挠绊憽Ｒ虼?，在微觀尺度上揭示介導(dǎo)偶發(fā)性N2O的微生物相互作用排放對(duì)于制定緩解戰(zhàn)略至關(guān)重要。
Bioscreen全自動(dòng)微生物生長曲線分析儀應(yīng)用
CB培養(yǎng)基（見血清瓶測(cè)定）用于測(cè)定熒光假單胞菌JL1對(duì)菌絲分泌物或其主要化合物的生長反應(yīng)。培養(yǎng)基中補(bǔ)充了300 mg L?1 NH4+-N（NH4Cl）和10%的維生素（相對(duì)于MSR培養(yǎng)基），以確保足夠的細(xì)菌同化。熒光假單胞菌JL1將懸浮液接種到250μL CB培養(yǎng)基中，并在10×10孔蜂窩微孔板中培養(yǎng)（初始OD600值0.05）。使用Bioscreen C全自動(dòng)生長曲線分析儀在30°C下每2小時(shí)測(cè)量一次OD600值，持續(xù)24小時(shí)，生長曲線分析系統(tǒng)（Oy growth CurvesAb，芬蘭），每次處理4次重復(fù)。
圖1：實(shí)驗(yàn)流程圖
該研究包括幾個(gè)實(shí)驗(yàn)：兩個(gè)盆栽實(shí)驗(yàn)，體外實(shí)驗(yàn)和一個(gè)接種實(shí)驗(yàn)。兩個(gè)盆栽實(shí)驗(yàn)（盆栽實(shí)驗(yàn)1和2）測(cè)試了AMF向殘留物微位點(diǎn)的增殖是否可以減少N2O排放并分解調(diào)節(jié)途徑。我們還測(cè)試了菌絲層中微生物組的豐度;體外實(shí)驗(yàn)評(píng)估熒光假單胞菌與AMF共定植對(duì)降低N2O的重要性排放。我們分離了反硝化劑，并確定了菌絲滲出物的關(guān)鍵成分。然后我們檢查了趨化性，生長，N2O在體外培養(yǎng)條件下響應(yīng)AMF滲出物和關(guān)鍵化合物的熒光假單胞菌的發(fā)射和反硝化基因表達(dá);最后，接種實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了AMF或AMF滲出的檸檬酸鹽對(duì)N2O的影響熒光假單胞菌在盆栽中的發(fā)射和nosZ基因表達(dá)。使用概念模型來說明AMF與熒光假單胞菌相互作用以減輕N2O的途徑生產(chǎn)。
圖2：在沒有AMF（-AMF）或有AMF（+AMF）的情況下，斑塊的N2O排放。
圖3：在沒有或存在AMF的情況下，nirK，nirS，nosZ（I族和II族）的基因和轉(zhuǎn)錄拷貝，以及在沒有或有AMF的情況下的nosZ I/（nirK+nirS）比例
結(jié)論：我們的研究為AMF在介導(dǎo)氮轉(zhuǎn)化過程中的重要性提供了新的見解，主要由反硝化菌進(jìn)行，導(dǎo)致級(jí)聯(lián)對(duì)土壤N2O的影響排放，我們證明了AMF豐富了N2O菌絲層中的還原假單胞菌，這是N2O下降的原因殘留物斑塊中的排放。值得注意的是，羧酸鹽菌絲滲出作為引誘劑，熒光素JL1和作為興奮劑觸發(fā)nosZ基因的表達(dá)。這些見解為微生物與菌絲圈中微生物公會(huì)之間的有趣相互作用提供了新穎的機(jī)制理解，表明這些營養(yǎng)性微生物的相互作用如何如何對(duì)微生境的反硝化過程產(chǎn)生實(shí)質(zhì)性影響的過程。這些知識(shí)為我們開辟了新的途徑利用跨生物界的微生物相互作用來實(shí)現(xiàn)可持續(xù)的農(nóng)業(yè)和減緩氣候變化。
張俊伶教授課題組長期從事AM真菌介導(dǎo)氧化亞氮減排與土壤健康評(píng)價(jià)體系建立與探究，近年來圍繞AM真菌-菌絲際微生物互作減緩?fù)寥繬2O排放機(jī)制等方面
（1）首先發(fā)現(xiàn)AM真菌能夠富集nosZ型反硝化菌減少大豆殘茬N2O的排放
農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中N2O的排放主要是豆科植物殘?jiān)诜纸膺^程中產(chǎn)生的，來自共耕間作植物的AM真菌可以增殖到微生物群落中并與土壤微生物相互作用以減少N2O排放。然而，菌根菌絲如何影響豆科植物作物殘茬中硝化菌和反硝化菌及其機(jī)制仍不清楚。該文章通過根盒隔網(wǎng)兩分室盆栽實(shí)驗(yàn)評(píng)估近鄰玉米AM真菌菌絲對(duì)結(jié)瘤大豆和非結(jié)瘤大豆N2O的排放的影響。AM真菌菌絲持續(xù)減少了20.8%-61.5%的N2O排放，并改變了土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，提高了nosZ型硝化細(xì)菌的相對(duì)豐度，而這一過程可能與土壤中微生物生物量碳和水溶性有機(jī)碳的增加有一定的關(guān)系（Environmental Microbiology,2021）。
（2）隨后證明AM真菌招募完全反硝化細(xì)菌假單胞菌緩解土壤N2O排放，揭示了AM真菌-菌絲際微生物互作促進(jìn)完全反硝化過程降低N2O排放機(jī)制
作物殘?bào)w還田可以提高土壤養(yǎng)分，增加土壤有機(jī)碳等，是一項(xiàng)重要的農(nóng)田管理措施。然而作物殘?bào)w還田后，尤其是豆科作物收獲后，在其根茬區(qū)會(huì)出現(xiàn)一個(gè)N2O排放高峰，這將部分抵消豆科固氮帶來的收益。因此如何降低豆科根茬區(qū)N2O排放量，對(duì)緩解氣候變化、促進(jìn)農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展具有重要指導(dǎo)意義。該文章首先采用盆栽試驗(yàn)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)根茬區(qū)N2O排放，并利用熒光定量PCR、擴(kuò)增子測(cè)序和宏基因組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)AMF根外菌絲富集了nosZ型反硝化細(xì)菌尤其是假單胞菌，形成區(qū)別于土體的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，增加和上調(diào)了nosZ基因豐度和表達(dá)，促進(jìn)了N2O還原過程，從而減少了蠶豆根茬區(qū)N2O排放。隨后開展了系列的純培養(yǎng)試驗(yàn)和反硝化細(xì)菌回接試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)菌絲分泌物中的羧酸鹽是觸發(fā)熒光假單胞菌JL1菌株nosZ基因表達(dá)上調(diào)并減緩凈N2O排放的主要物質(zhì)。最后在11年的玉米/蠶豆間作試驗(yàn)田進(jìn)行了大田取樣分析，進(jìn)一步驗(yàn)證了菌絲密度與nosZ基因豐度之間存在顯著正相關(guān)性（Microbiome,2023）。
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