溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)屬于弧菌科(Vibrionaceae)弧菌屬(Vibrio)，為革蘭氏陰性短桿菌，無(wú)莢膜和芽孢，是廣泛存在于海水中的一種條件致病菌。它不僅對(duì)于魚、蝦、貝有致病性，同時(shí)對(duì)于人類也有一定的致病性，能夠引起腹瀉和食物中毒。而對(duì)于溶藻弧菌的防治，養(yǎng)殖戶通常使用傳統(tǒng)的抗生素或者消毒劑，但抗生素的濫用會(huì)導(dǎo)致養(yǎng)殖過程中溶藻弧菌產(chǎn)生耐藥性，不僅影響用藥效果，同時(shí)耐藥菌還會(huì)隨著食物鏈的傳播感染人類，危害人類生命安全。另一方面，隨著人們生活水平的不斷提高，大眾在食品的選擇上對(duì)綠色理念越發(fā)的重視。因此，亟需尋找一種新的既環(huán)保、友好又能有效控制水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物溶藻弧菌病的方法。


噬菌體作為一種微生物病毒，能夠侵染并裂解細(xì)菌、螺旋體、放線菌等。早在20世紀(jì)初期，噬菌體就被認(rèn)為有替代抗生素的巨大潛力。相比于抗生素的高效，有關(guān)噬菌體療法的研究始終落后于抗生素的研究。但隨著近年來(lái)細(xì)菌耐藥性問題趨向嚴(yán)峻，研究者重新將目光投向噬菌體，期望能夠開發(fā)出高效的噬菌體制劑。2009年，Wright等首次在感染多重耐藥銅綠假單胞菌的慢性耳炎患者身上使用噬菌體治療方案，經(jīng)過治療后，患者的癥狀均得到改善，并且沒有產(chǎn)生毒副作用。Cao等從臨床患者體內(nèi)分離得到一株多重耐藥性肺炎克雷伯菌，并用其感染小鼠，隨后使用噬菌體進(jìn)行治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)未使用噬菌體治療的小鼠在24 h內(nèi)全部死亡，而使用噬菌體治療的小鼠存活率則高出許多。此外，噬菌體在弧菌病防治方面的研究也取得了一些成果。Stalin等研究發(fā)現(xiàn)，在斑節(jié)對(duì)蝦幼體感染哈維氏弧菌后，使用噬菌體能夠有效提高幼體的存活率。胡蝶等將副溶血弧菌制成噬菌體微膠囊，并拌于飼料中投喂方斑東風(fēng)螺和南美白對(duì)蝦，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)生物的腸道和水體中的宿主菌都有大幅度的減少。于鴿從自然水體中分離得到一株溶藻弧菌噬菌體，并將其用于南美白對(duì)蝦的攻毒實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明108pfu/mL的噬菌體溶液的保護(hù)率達(dá)88.20%。Sasikala等分離得到的一株溶藻弧菌噬菌體能夠有效抑制溶藻弧菌的生物膜形成，并且在數(shù)個(gè)小時(shí)后還對(duì)溶藻弧菌有殺滅作用。


本文以溶藻弧菌V039為宿主，分離得到一株新型溶藻弧菌噬菌體φV039C，并對(duì)其進(jìn)行了電鏡形態(tài)觀察、最佳感染復(fù)數(shù)、一步生長(zhǎng)曲線等生物學(xué)特性的研究，以及全基因測(cè)序、序列分析和功能預(yù)測(cè)，以期更好地了解其裂解機(jī)制，為溶藻弧菌的噬菌體治療提供依據(jù)。


1、材料與方法


1.1材料


宿主菌：病原菌(溶藻弧菌V039)從福建漳浦的對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)中分離得到，并由本實(shí)驗(yàn)室保藏。


主要試劑和儀器：LB肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂(NA)、瓊脂粉、SM病毒提取緩沖液均購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；DL15000、DL2000、DNase I、RNase A和限制性內(nèi)切酶(EcoR I、EcoR V、BamH I、HindⅢ)均為日本TaKaRa公司產(chǎn)品；TIANamp病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；透射電子顯微鏡(TEM)為美國(guó)FEI公司制造產(chǎn)品；離心機(jī)(Eppendorf 5427R)為德國(guó)艾本德公司產(chǎn)品。


1.2方法


1.2.1噬菌體的分離


將取自福建漳浦各對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)的水樣混合于潔凈的水桶中，再把培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的溶藻弧菌V039菌液倒入水樣中，混勻后置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中24 h，以富集潛在噬菌體。之后，取5 mL富集液10 000 r/min離心3 min，上清液用0.22μm濾膜過濾備用。吸取100μL V039菌液均勻涂布在營(yíng)養(yǎng)瓊脂(添加體積分?jǐn)?shù)為2%的NaCl)上，吸取10μL富集液分?jǐn)?shù)滴點(diǎn)于平板上，晾干后置于30℃培養(yǎng)，24 h后觀察點(diǎn)接處是否有空斑出現(xiàn)，如有空斑即作為溶藻弧菌V039的噬菌體進(jìn)行挖斑純化。


1.2.2噬菌體的純化與效價(jià)測(cè)定


采用雙層平板法進(jìn)行純化和效價(jià)測(cè)定。將噬菌體形成的空斑挖到SM緩沖液中，4℃過夜。用無(wú)菌生理鹽水將浸提液稀釋到合適梯度，吸取100μL稀釋液和100μL宿主菌液至6 mL半固體(含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.65%的瓊脂)LB肉湯(提前置于50℃保溫)中混合均勻，傾倒在營(yíng)養(yǎng)瓊脂(添加體積分?jǐn)?shù)為2%的NaCl)上，凝固后30℃培養(yǎng)16 h。挑取單個(gè)噬菌斑至SM緩沖液中4℃過夜，重復(fù)上述操作對(duì)分離得到的噬菌體純化3～5次。噬菌體效價(jià)(TT)指的是每毫升樣品中含有的具有侵染性的噬菌體顆粒數(shù)，又稱噬菌斑形成單位數(shù)(plaque-forming unit)。檢測(cè)樣品梯度稀釋后做雙層平板法培養(yǎng)，每個(gè)梯度設(shè)3個(gè)平行，取噬菌斑顆粒數(shù)在30～300 pfu之間為有效數(shù)據(jù)，以平均數(shù)計(jì)算噬菌體密度。


1.2.3噬菌體電鏡觀察


取噬菌體增殖液20μL(>1010pfu/mL)滴到銅網(wǎng)上吸附30 min，用2%(體積分?jǐn)?shù))磷鎢酸(PTA)負(fù)染10 min，室溫干燥后，用透射電子顯微鏡觀察并拍攝噬菌體的形態(tài)，同時(shí)測(cè)量頭部直徑等數(shù)據(jù)。


1.2.4噬菌體基因組的提取和酶切分析


取噬菌體增殖液(≥1010pfu/mL)至無(wú)菌EP管中，分別加入DNase I與RNase A于37℃反應(yīng)1 h，以去除噬菌體增殖液中游離的宿主菌DNA/RNA，80℃處理15 min使酶失活。之后，利用TIANamp病毒基因組DNA/RNA試劑盒提取噬菌體基因組。


酶切反應(yīng)體系為10μL。分別取噬菌體基因組8μL于6個(gè)無(wú)菌PCR管中，再分別加入1μL的酶(DNase I、RNase A、EcoR I、EcoR V、BamH I、Hind III)以及1μL的10×Loading Buffer，于37℃反應(yīng)1 h。將酶切產(chǎn)物置于1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠中電泳(110 V)24 min，使用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。


1.2.5噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)測(cè)定


感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)，指的是噬菌體在感染開始時(shí)噬菌體與宿主菌的比值。測(cè)定方法：培養(yǎng)宿主菌液至生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，按MOI值為1000、100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001、0.000 01各吸取50μL的噬菌體液和宿主菌液到900μL無(wú)菌LB肉湯中，30℃、160 r/min培養(yǎng)8 h，10 000 r/min離心2 min，用0.22μm濾膜過濾，測(cè)定噬菌體效價(jià)。效價(jià)最高的感染復(fù)數(shù)即為最佳感染復(fù)數(shù)。


1.2.6噬菌體一步生長(zhǎng)曲線測(cè)定


按照感染復(fù)數(shù)為0.1的比例，混合噬菌體液和宿主菌液，宿主菌液濃度為1×108cfu/mL，總體積為1 mL，30℃孵育10 min，讓噬菌體充分吸附在宿主菌上，10 000 r/min離心2 min，棄上清液，用LB肉湯洗滌2次去除未吸附的噬菌體，加入1 mL LB肉湯重懸。置于30℃的恒溫培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)，并開始計(jì)時(shí)，分別在0、10、20、30、40、50、60 min時(shí)間點(diǎn)取樣，測(cè)定噬菌體效價(jià)并繪制生長(zhǎng)曲線。


1.2.7噬菌體的全基因組測(cè)序及生物信息學(xué)分析


噬菌體φV039C的基因組利用第三代單分子測(cè)序平臺(tái)(PacBio SMRT)進(jìn)行全基因組測(cè)序分析。利用GeneMarkS(http://topaz.gatech.edu/GeneMark/)網(wǎng)站進(jìn)行基因預(yù)測(cè)。使用在線blastp工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)進(jìn)一步對(duì)預(yù)測(cè)的基因進(jìn)行注釋。使用軟件DNA Plotter繪制全基因組圈圖。用MEGA 7.0軟件，選擇N-乙酰壁氨酰-L-丙氨酸酰胺酶(ORF6)和大亞基終止酶(ORF19)兩種蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。



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