目的探討生長抑制因子5（ING5）抑制肺癌細(xì)胞增殖的作用。方法采用慢病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染方法建立A549細(xì)胞ING5高表達(dá)細(xì)胞系A(chǔ)549-ING5-OE和A549細(xì)胞空質(zhì)粒對照細(xì)胞系A(chǔ)549-control。采用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察ING5過表達(dá)對肺癌A549細(xì)胞增殖能力的影響；采用皮下接種方法建立裸鼠皮下移植瘤模型，觀察ING5對裸鼠皮下成瘤能力及腫瘤體積大小的影響。結(jié)果本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了肺癌A549-ING5過表達(dá)細(xì)胞系，與A549-control比較，細(xì)胞系A(chǔ)549-ING5-OE中ING5表達(dá)顯著增高；增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ING5高表達(dá)顯著抑制了肺癌細(xì)胞的增殖能力；克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示細(xì)胞系A(chǔ)549-ING5-OE中ING5高表達(dá)的肺癌細(xì)胞克隆形成能力明顯低于A549-control肺癌細(xì)胞（P＜0.01）；裸鼠在體水平研究結(jié)果顯示ING5高表達(dá)可以抑制裸鼠皮下成瘤及移植瘤的生長。結(jié)論ING5可以抑制肺癌細(xì)胞的增殖，為臨床治療肺癌提供新的治療靶點(diǎn)。


肺癌的發(fā)生是個(gè)涉及多基因改變的復(fù)雜過程，其中癌基因的激活和抑癌基因的失活是兩大關(guān)鍵要素。生長抑制因子（inhibitor of growth，ING）作為候選抑癌基因家族在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起重要抑制作用，目前已發(fā)現(xiàn)5個(gè)成員，包括ING1、ING2、ING3、ING4、ING5。ING編碼的蛋白在結(jié)構(gòu)上具有相似性，功能上存在共同的作用，ING蛋白參與磷脂酰肌醇介導(dǎo)的脂類信號通路及激素介導(dǎo)的通路，抑制細(xì)胞生長，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和DNA損傷修復(fù)，同時(shí)ING蛋白也具有各自的特點(diǎn)］。在多種腫瘤中ING家族基因的表達(dá)均下調(diào)，已有的研究表明，在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中ING1、ING2、ING4均起到重要作用。ING5作為家族的最新成員于2003年被首次報(bào)道。2006年Cote課題組研究揭示ING5參與構(gòu)成兩種組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶（HAT）復(fù)合體，并且能與組蛋白結(jié)合而作為連接HAT與組蛋白的橋梁分子參與組蛋白修飾和染色質(zhì)重構(gòu)，表明ING5可通過輔助HAT表觀調(diào)控基因表達(dá)而發(fā)揮抑癌作用。ING5與臨床腫瘤發(fā)生的關(guān)系研究表明，61%的原發(fā)口腔腫瘤組織中ING5 mRNA水平降低，31例中有3例檢測到ING5基因發(fā)生突變；在肝癌組織中ING5 mRNA表達(dá)量下降，起到抑癌基因的作用；在食管鱗癌組織中ING5 mRNA的表達(dá)量同樣下降。進(jìn)一步研究表明ING5可與P53相互作用，并促進(jìn)P53轉(zhuǎn)錄活化，而引起結(jié)腸癌細(xì)胞周期阻滯和凋亡。但I(xiàn)NG5在肺癌中的作用尚未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)擬建立ING5高表達(dá)肺癌細(xì)胞株，采用細(xì)胞增殖、克隆形成及裸鼠皮下荷瘤模型探討ING5對肺癌細(xì)胞的抑制作用。


1材料與方法


1.1材料


A549細(xì)胞（中科院上海細(xì)胞庫），GV218載體購自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司，蛋白定量試劑盒、SDSPAGE凝膠配制試劑盒、細(xì)胞裂解液均購自西安碧云天科技生物有限公司，蛋白酶抑制劑購自瑞士Roche，G418購自美國Gibco，細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM高糖、胎牛血清、胰蛋白酶消化液均購自美國HyClone，青鏈霉素混合液購自北京Solarbio，ING5抗體購自美國Proteintech，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國Advansta，兔二抗購自英國Abcam，電子游標(biāo)卡尺購自哈爾濱量具刃具有限責(zé)任公司，4%多聚甲醛購自西安科昊生物技術(shù)有限公司，裸鼠由第四軍醫(yī)大學(xué)（以下簡稱“我校”）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。


1.2 GV218慢病毒載體轉(zhuǎn)染構(gòu)建A549-ING5-OE和A549-control細(xì)胞系


含ING5 cDNA的慢病毒載體和對照載體為吉?jiǎng)P公司構(gòu)建。用胰蛋白酶消化液消化293T細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為6×105個(gè)/mL，接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿，待細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前2 h將培養(yǎng)液換成無血清培養(yǎng)液，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入293T細(xì)胞培養(yǎng)液中，培養(yǎng)8 h后棄掉含有轉(zhuǎn)染復(fù)合物的培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞，加入10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)。48 h后收集293T細(xì)胞上清液，1000 r/min離心除去細(xì)胞碎片，收集上清即為病毒顆粒濃縮液。對數(shù)生長期A549細(xì)胞，培養(yǎng)液中加入病毒顆粒濃縮液進(jìn)行感染，12 h后觀察細(xì)胞狀態(tài)，沒有明顯的細(xì)胞毒副作用，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后更換新的培養(yǎng)液，感染3 d后觀察GFP基因的的表達(dá)。感染后A549細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整密度為300個(gè)/孔，接種至6孔板，用G418篩選，藥物濃度為5μg/mL，每隔24 h更換新的培養(yǎng)液，篩選3 d后，用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞克隆，挑取陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，直至獲得需要的細(xì)胞量。


1.3 Western blot檢測ING5在A549-control和A549-ING5-OE細(xì)胞中的表達(dá)


收集對數(shù)生長期A549-control和A549-ING5-OE細(xì)胞在冰上裂解30 min，細(xì)胞裂解液為150 mmol/L NaCl、1%NP-40、0.5%去氧膽酸、0.1%SDS、50 mmol/L Tris（pH 8.0），蛋白酶抑制劑（1∶25），裂解后高速離心20 min，收集上清即為細(xì)胞總蛋白，蛋白定量試劑盒定量。SDS-PAGE凝膠配制試劑盒配制10%的凝膠。電泳，樣品在濃縮膠電壓100 V，20 min，在分離膠電壓120 V繼續(xù)電泳。轉(zhuǎn)膜，電壓55 V，210 min，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用麗春紅染液染色，PBST脫色。牛奶封閉1 h，一抗ING5（1∶1000）封閉4℃過夜。PBST洗3次，每次5 min，二抗封閉1 h，PBST洗3次，每次5 min。用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑盒（Amersham Bioscience）檢測蛋白的表達(dá)。

1.4檢測ING5對肺癌細(xì)胞增殖的抑制


將對數(shù)生長期A549-control和A549-ING5-OE細(xì)胞用胰蛋白酶消化液消化，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104個(gè)/孔，接種至24孔板，兩種細(xì)胞各種4個(gè)復(fù)孔，每孔加1 mL 10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液。從細(xì)胞貼壁開始計(jì)時(shí)24、48、72、96 h后各計(jì)數(shù)1次。


1.5檢測ING5對肺癌細(xì)胞克隆形成能力的抑制


將對數(shù)生長期A549-control和A549-ING5-OE細(xì)胞用胰蛋白酶消化液消化，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為300個(gè)/孔，接種至6孔板，每孔加2 mL 10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液。細(xì)胞接種5 d后每孔各加500μL胎牛血清繼續(xù)培養(yǎng)。貼壁生長15 d后，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定15 min。固定后用0.1%結(jié)晶紫溶液染色15 min，PBS輕輕沖洗細(xì)胞，室溫風(fēng)干后計(jì)數(shù)多于50個(gè)細(xì)胞的克隆。根據(jù)公式計(jì)算克隆形成率：克隆形成率（%）=克隆數(shù)/300×100%。


1.6 ING5抑制裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)


出生4周雄性裸鼠，對照組和實(shí)驗(yàn)組各7只隨機(jī)分組，由第四軍醫(yī)大學(xué)（以下簡稱“我?！保?shí)驗(yàn)動(dòng)物中心代養(yǎng)。裸鼠適應(yīng)7 d后，將對數(shù)生長期A549-control和A549-ING5-OE細(xì)胞用胰蛋白酶消化液消化，計(jì)數(shù)，調(diào)整密度為每只裸鼠5×106個(gè)/200μL，混勻在無血清DMEM培養(yǎng)液，分別接種至對照組和實(shí)驗(yàn)組裸鼠皮下。7 d后裸鼠皮下成瘤，每隔3 d用電子游標(biāo)卡尺測1次移植瘤長徑（a）和短徑（b），并計(jì)算腫瘤體積（V）：ab2/2，繪制腫瘤生長曲線。裸鼠實(shí)驗(yàn)遵循我校關(guān)于動(dòng)物保護(hù)和做好動(dòng)物福利規(guī)定，并經(jīng)我校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。


1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法


采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。


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