CRISPR系統(tǒng)是原核生物中發(fā)現(xiàn)的一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，可以保護宿主細胞免受外來DNA的入侵。作為噬菌體和細菌免疫系統(tǒng)之間持續(xù)斗爭的一部分，CRISPR系統(tǒng)已演變成各種類型，每種類型都具有不同的功能。II型Cas9是這些系統(tǒng)中研究最廣泛的，并且具有多種亞型。目前尚不確定該家族的成員是否能夠進化出額外的機制來對抗病毒入侵。在這里研究人員鑒定了2,062個完整的Cas9位點，預(yù)測其相關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)，并揭示了II-C型Cas9的三種結(jié)構(gòu)生長軌跡。我們發(fā)現(xiàn)新的相關(guān)基因(NAG)往往存在于較大的II-C Cas9的基因座內(nèi)。進一步研究表明，來自金黃桿菌屬的CbCas9含有一個新的β-REC2結(jié)構(gòu)域，并與II-C Cas9(PcrIIC1)的NAG編碼的CRISPR–Cas系統(tǒng)促進(pro-CRISPR)蛋白形成異四聚體復(fù)合物。
與獨立的CbCas9相比，CbCas9-PcrIIC1復(fù)合物表現(xiàn)出增強的DNA結(jié)合和切割活性、對原型間隔子相鄰基序序列的更廣泛的兼容性、對錯配的耐受性增強以及抗噬菌體免疫力的提高?？傮w而言，我們的工作在結(jié)構(gòu)水平上揭示了II-C Cas9蛋白的多樣性和“生長進化”軌跡，并鑒定了許多NAG，例如PcrIIC1，它作為前CRISPR因子來增強CRISPR介導(dǎo)的免疫。
Bioscreen全自動生長曲線分析儀的應(yīng)用
Bioscreen C是一種微生物生長曲線分析儀，用于監(jiān)測大腸桿菌（E.coli）在不同條件下的生長情況，生長條件是在37°C下培養(yǎng)，并每2小時測量一次OD600nm值。Bioscreen C用于測定在體內(nèi)毒性實驗中，含有不同質(zhì)粒（如表達MBP、SUMO、PcrIIC1或VapC毒素）的E.coli BW25141細胞在葡萄糖抑制蛋白表達或阿拉伯糖誘導(dǎo)蛋白表達條件下的吸光度（OD600nm）隨時間的變化。
實驗結(jié)果
成功制備了機械強度高的MCPC微凝膠，該微凝膠通過酚類金屬配位框架穩(wěn)定，用于益生菌和多酚的共同遞送。該微凝膠具有增強的益生菌胃酸保護、腸道響應(yīng)釋放和粘膜粘附特性的組合。棕色生物活性物質(zhì)天然結(jié)合在MCP多糖上，事實證明，MCP多糖是提高阿克曼氏菌豐度的精確益生元。MCPC/AKK通過依次在腸道中提供活性AKK并在肝臟中提供棕色抗氧化劑，有效改善APAP誘導(dǎo)的肝損傷。MCPC微凝膠在腸道中的高活性AKK可以恢復(fù)腸道微生物失調(diào)并促進SCFA產(chǎn)生，從而增強肝功能，調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和炎癥，并通過腸肝軸修復(fù)腸道屏障。
圖1、大型II-C Cas9與鄰近的NAG相關(guān)并表現(xiàn)出結(jié)構(gòu)生長軌跡。a)示意圖顯示已識別的II-A、II-B、II-C型和NAG相關(guān)II-C系統(tǒng)的CRISPR-Cas9系統(tǒng)的數(shù)量。顯示了GEM和HBGC數(shù)據(jù)集中已識別系統(tǒng)的數(shù)量。b)具有（NAG+）和不具有（NAG?）NAG的II-C Cas9的蛋白質(zhì)大小的比較。NAG+的中值為1,463個氨基酸，NAG?的中值為1,159個氨基酸。使用雙邊檢驗進行統(tǒng)計分析，并通過曼-惠特尼U檢驗確定顯著性。c)所有已識別的NAG的功能注釋。具有核酸結(jié)合功能的NAG呈紅色。d)示意圖顯示了II-C Cas9結(jié)構(gòu)預(yù)測、量化和降維分析的工作流程。PCA，主成分分析。e)II-C Cas9s蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的SGT分析平面。點的大小對應(yīng)于Cas9的大小，顏色對應(yīng)于SGT的偽時間。每個簇的標簽根據(jù)軌跡著色。f)每個軌跡的高級簇中的代表性Cas9結(jié)構(gòu)。NAG+Cas9的比例標記在頂部，不同簇中Cas9的總數(shù)標記在每個簇的底部。
圖2、CbCas9三元和CbCas9-PcrIIC1四元復(fù)合物的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。a)CbCas9 PAM偏好。左圖是隨機質(zhì)粒去除測定的示意圖。右圖是CbCas9 PAM偏好的WebLogo圖。數(shù)據(jù)代表具有相似結(jié)果的三個獨立實驗。b)CbCas9域組織的示意圖。c)根據(jù)b著色的完整R環(huán)（左）和部分R環(huán)（右）CbCas9三元復(fù)合物(CbCas9-sgRNA-dsDNA)的原子模型。HNH和CTH是無序的，不包含在兩個模型中。β-REC2中潛在的DNA結(jié)合賴氨酸殘基在部分R環(huán)CbCas9三元復(fù)合物中用綠色球體標記。d)CbCas9–PcrIIC1–sgRNA–dsDNA四元復(fù)合物（28 bp dsDNA底物）的冷凍電鏡圖（頂部）和原子模型（底部）。e)由兩個對稱CbCas9-PcrIIC1效應(yīng)子結(jié)合的兩個dsDNA底物（20-nt互補）的卡通圖。f)PcrIIC1二聚體和兩個CTH結(jié)構(gòu)域的原子模型，以及PcrIIC1和Mg 2+離子的冷凍電鏡圖（半透明）。與活性口袋中的Mg 2+相互作用的殘基以紅色顯示。g)描述CbCas9的CTH結(jié)構(gòu)域和PcrIIC1的NCP之間結(jié)合的局部結(jié)構(gòu)模型。
圖3、PcrIIC1增強CbCas9的體外DNA干擾活性。a，CbCas9和CbCas9-PcrIIC1 PAM偏好的WebLogo圖。數(shù)據(jù)代表具有相似結(jié)果的三個獨立實驗。b，熱圖顯示CbCas9-PcrIIC1和CbCas9之間PAM偏好的倍數(shù)變化。與CbCas9組相比，較暖的顏色表明CbCas9-PcrIIC1組對PAM的偏好增加。c，CbCas9和CbCas9-PcrIIC1效應(yīng)子對含有各種PAM（ACAAA、ACAAC和ACGTC）的靶dsDNA進行體外切割的模型（左）和效率圖（右）；在0、2、5、15、30、60、90和120分鐘時收集等分試樣。數(shù)據(jù)為平均值±標準差（n=3個獨立重復(fù)）。CbCas9的每個PAM的平臺值分別為66.88、46.98和26.77，CbCas9-PcrIIC1的每個PAM的平臺值分別為71.84、65.37和53.15。Cb和Cb+P分別表示CbCas9和CbCas9-PcrIIC1效應(yīng)子。d，使用CbCas9和CTH突變的CbCas9（CbCas9-CTH mut；K1431E、K1433E、K1435E和R1442E）使用ACAAC PAM對目標dsDNA進行的模型（左）和切割效率圖（右），在有或沒有PcrIIC1的情況下孵育；在0、2、5、15、30、60、90和120分鐘時收集等分試樣。數(shù)據(jù)為平均值±標準差（n=3個獨立重復(fù)）。Cb-CTH mut和Cb-CTH mut+P分別表示CTH突變的CbCas9和CTH突變的CbCas9-PcrIIC1效應(yīng)子。e，左圖，用于目標dsDNA的R環(huán)形成的smFRET測定示意圖，其中TS上有Cy3標記，NTS上有Cy5標記。右圖為僅DNA、PcrIIC1、dCbCas9和dCbCas9-PcrIIC1樣品的FRET直方圖。
圖4：CbCas9-PcrIIC1復(fù)合物通過兩個CbCas9效應(yīng)子增強dsDNA篩選和dsDNA入侵能力。a，CbCas9-PcrIIC1-sgRNA-dsDNA非靶向復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)以半透明冷凍電鏡圖顯示，核酸以原子模型顯示。b，a中CbCas9-PcrIIC1非靶向復(fù)合物的側(cè)視圖。B型DNA模擬物顯示為半透明模型。c，非靶向復(fù)合物中CbCas9-PcrIIC1與dsDNA靶標結(jié)合的示意圖。d，CbCas9-PcrIIC1-sgRNA-dsDNA（對稱20-nt互補）雙靶向復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)以半透明冷凍電鏡圖顯示，核酸以原子模型顯示。e，雙靶向復(fù)合物中CbCas9-PcrIIC1結(jié)合dsDNA靶標的示意圖。f，含有兩種不同原型間隔子（原型間隔子-1（紅色）和原型間隔子-2（藍色）的Fam標記的靶dsDNA的體外切割。右下角是不同裂解產(chǎn)物的圖表。g，示意圖顯示CbCas9的單鏈搜索和CbCas9-PcrIIC1復(fù)合物的雙鏈搜索。
圖5、通過與MCPC介導(dǎo)的相互作用增強腸道粘膜粘附和益生菌定植。A)粘膜粘附曲線，B)MCPC和MCP對大鼠腸粘膜的最大分離力(MSF)和總粘附功(TAW)。C)MCPC濃度對粘液粘附益生菌影響的菌落計數(shù)。D)粘液（用綠色Alexa Fluor 488-WGA標記）滲透無紅色和嵌入NZ9000的CLSM 3D圖像。E)FITC標記的游離WCFS1或MCPC/WCFS1在胃腸道中的滯留。F)紅色游離NZ9000或MCPC/NZ9000在腸粘液中的分布?？漳c粘液用綠色Alexa Fluor 488-WGA染色，腸絨毛細胞核用藍色DAPI染色。G)小鼠糞便中各種AKK的菌落計數(shù)。
總結(jié)
CRISPR系統(tǒng)是原核生物（如細菌）中的一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，能夠保護宿主細胞免受外來DNA的入侵，尤其是噬菌體的攻擊。研究者們鑒定了2,062個完整的Cas9位點，并預(yù)測了其相關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)，揭示了II-C型Cas9的三種結(jié)構(gòu)生長軌跡。研究發(fā)現(xiàn)新的相關(guān)基因（NAG）通常存在于較大的II-C型Cas9的基因座內(nèi)。特別是來自金黃桿菌屬的CbCas9含有一個新的β-REC2結(jié)構(gòu)域，并與PcrIIC1蛋白形成異四聚體復(fù)合物。PcrIIC1蛋白是一種無毒的核酸酶，對單鏈DNA(ssDNA)和單鏈RNA(ssRNA)具有核酸酶活性，但其生物學(xué)作用與典型的PIN域毒素不同。CbCas9-PcrIIC1復(fù)合物表現(xiàn)出增強的DNA結(jié)合和切割活性，對原型間隔子相鄰基序（PAM）序列的更廣泛兼容性，對錯配的耐受性增強，從而提高了抗噬菌體免疫力。通過冷凍電鏡分析，研究者們揭示了CbCas9-PcrIIC1復(fù)合物的詳細結(jié)構(gòu)，包括它們?nèi)绾螀f(xié)同作用于長dsDNA底物，以及如何通過雙重靶向來增強DNA干擾能力。研究提供了關(guān)于II-C型Cas9蛋白從緊湊到大型的進化生長軌跡的新視角，并探討了這些進化趨勢與細菌宿主的進化關(guān)系。PcrIIC1蛋白的發(fā)現(xiàn)不僅增進了研究人員對細菌免疫機制的理解，而且為CRISPR-Cas9系統(tǒng)在生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用提供了新的可能性，尤其是在提高基因編輯精度和適應(yīng)性方面。研究運用了多種先進的生物信息學(xué)工具和實驗技術(shù)，如AlphaFold2結(jié)構(gòu)預(yù)測、冷凍電鏡（cryo-EM）和單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移（smFRET）等，來揭示Cas9蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。本項研究不僅在結(jié)構(gòu)水平上揭示了II-C Cas9蛋白的多樣性，而且鑒定了PcrIIC1這樣的新型CRISPR相關(guān)蛋白，為理解CRISPR-Cas系統(tǒng)的進化和功能提供了重要信息，并為未來的生物技術(shù)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
相關(guān)新聞推薦
1、AR113和bsh敲除的植物乳桿菌菌株的生長狀態(tài)評估
2、銅綠假單胞菌Pa021的分離及鑒定、一步生長曲線、殺菌曲線繪制
3、腸膜明串珠菌腸膜亞種LA-07生長曲線制作和世代時間計算