濃香型白酒窖香濃郁、綿甜醇厚、香味協(xié)調(diào)、尾凈余長，是最受消費(fèi)者喜愛的白酒之一。濃香型白酒以高粱、大米、玉米等淀粉質(zhì)谷糧為原料，以中溫大曲為糖化發(fā)酵劑，經(jīng)長時(shí)間的泥窖密封發(fā)酵后蒸餾而得，其中泥窖密封發(fā)酵是形成濃香型白酒風(fēng)味的過程，也是多種微生物繁衍更替的過程。窖泥是濃香型白酒制勝的法寶，也是生產(chǎn)必不可少的基礎(chǔ)，其內(nèi)含有大量的生香功能菌，這些功能菌代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸類物質(zhì)在酯化酶作用下合成的酯類物質(zhì)是濃香型白酒窖香濃郁的根本。因此，加強(qiáng)窖泥中的酯化菌的研究對(duì)提升窖內(nèi)酒醅質(zhì)量具有重要意義。
目前為止，對(duì)窖泥中厭氧微生物的研究已超過幾百種，其中生香功能細(xì)菌主要包括己酸菌、芽孢桿菌、乳酸菌、羧酸菌等。研究發(fā)現(xiàn)，梭狀芽孢桿菌（Clostridium）對(duì)濃香型白酒的濃郁窖香具有重要貢獻(xiàn)，其代謝產(chǎn)物主要為己酸和丁酸，同時(shí)伴隨一些氫的產(chǎn)生。當(dāng)甲烷菌與同產(chǎn)己酸的梭菌共生時(shí)能有效促進(jìn)己酸乙酯生成，該研究對(duì)復(fù)合功能菌液和人工窖泥的改造培養(yǎng)提供了重要理論指導(dǎo)。此外，研究發(fā)現(xiàn)，窖池中的酯化菌以芽孢菌為主，對(duì)瀘州老窖不同窖齡的窖泥中產(chǎn)香的兼性厭氧菌進(jìn)行分類計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)芽孢乳桿菌屬（Sporolactobacillus）和芽孢桿菌屬（Bacillus）為窖池優(yōu)勢菌屬，其中大多菌株能產(chǎn)生丁酸和己酸等有機(jī)酸；研究發(fā)現(xiàn)白酒在發(fā)酵中、后期，酒醅中的芽孢桿菌大量增殖，成為優(yōu)勢菌群，是重要的酯化生香菌。
針對(duì)窖泥酯化生香菌微生物多為厭氧芽孢桿菌，本試驗(yàn)以優(yōu)質(zhì)老窖泥為研究對(duì)象，厭氧條件下富集酯化菌，并對(duì)富集條件進(jìn)行優(yōu)化，通過頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（headspace solid-phase microextraction-gas chromatographicmass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）技術(shù)對(duì)富集液中的酯類物質(zhì)及其含量進(jìn)行檢測，確定富集效果；再通過傳統(tǒng)培養(yǎng)分離方法從中篩選產(chǎn)己酸乙酯和丁酸乙酯的菌株，采用形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)及分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行菌種鑒定，并研究其生長特性，以期為提高濃香型白酒酒質(zhì)奠定基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1材料與試劑
1.1.1樣品
窖泥：無菌操作采集瀘州某名優(yōu)酒廠老窖池底泥，迅速置于冰盒運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，4℃冰箱保存。
1.1.2培養(yǎng)基
富集培養(yǎng)基：乙酸鈉3.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、牛肉粉10.0g/L、L-半胱氨酸鹽0.25g/L、酵母粉3.0g/L、葡萄糖5.0 g/L、可溶性淀粉1.0 g/L、氯化鈉5.0 g/L、超純水1 000 mL、pH值為6.0±0.1，121℃高壓蒸汽滅菌15 min。
篩選培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L、氯化鈉0.01 g/L、磷酸氫二鉀0.5 g/L、硫酸亞鐵0.01 g/L、磷酸二氫鉀0.5 g/L、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.25 g/L、硫酸錳0.01 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、甲基磺酸乙酯（ethyl methyl sulfonate，EMS）0.5 g/L、蛋白胨0.1 g/L、酵母膏1.0 g/L、瓊脂20 g/L、三丁酸甘油酯4 mL（在倒平板前加入）、超純水1 000 mL，自然pH值，121℃高壓蒸汽滅菌15 min。液體培養(yǎng)基中不添加瓊脂。
1.1.3試劑
乙酸鈉、蛋白胨、牛肉粉、酵母粉、葡萄糖、可溶性淀粉、氯化鈉、磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸鎂、瓊脂、三丁酸甘油酯（均為分析純）、乙酸正丁酯（色譜純）：成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司；EMS、L-半胱氨酸鹽酸鹽（均為分析純）：北京索萊寶科技有限公司。
1.2儀器與設(shè)備
HVE壓力蒸汽滅菌鍋；BF-2000M氮?dú)獯禎饪s儀；LRH-250恒溫培養(yǎng)箱、HW326恒溫水浴鍋；M367983聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀；YIQI-125凝膠成像系統(tǒng)；7890A-5975B氣相色譜-質(zhì)譜儀；α1860紫外分光光度計(jì)；AW200SG厭氧工作站。
1.3方法
1.3.1窖泥中酯化菌的富集方法
稱取5 g窖泥裝入含有45 mL無菌水的螺口瓶中，90℃恒溫水浴處理30 min，冷卻后于厭氧工作站按5%（V/V）的接種量接入富集培養(yǎng)基中，34℃條件下培養(yǎng)。
1.3.2窖泥中酯化菌富集條件的確定
富集時(shí)間：樣品同1.3.1處理后，分別于34℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0 d、8 d、12 d、16 d、20 d、24 d、28 d，每組試驗(yàn)3組平行。
富集次數(shù)：樣品同1.3.1處理后，在最佳富集時(shí)間下對(duì)富集液連續(xù)富集4次。
通過HS-SPME-GC-MS檢測富集液中酯類物質(zhì)含量及種類確定最佳富集時(shí)間和次數(shù)。
1.3.3窖泥中酯化菌的分離純化
將富集液于90℃恒溫水浴處理30 min后，吸取1 mL富集液，按10倍梯度稀釋至10-5，選取稀釋梯度為10-2～10-5的菌液0.1 mL分別涂布至篩選培養(yǎng)基（已在厭氧工作站中靜置24 h），34℃條件下培養(yǎng)2～10 d（期間觀測菌落變化），挑選有透明圈的菌落進(jìn)行分離、純化。將純化后的單菌株接種于富集培養(yǎng)基中（加入2%（V/V）乙醇），34℃培養(yǎng)15 d，通過GC-MS檢測發(fā)酵產(chǎn)物中有無己酸乙酯或丁酸乙酯。
1.3.4窖泥中酯化菌培養(yǎng)條件研究
種子液制備：于厭氧工作站中將目的菌株分別接種于液體篩選培養(yǎng)基中，34℃條件下嚴(yán)格厭氧培養(yǎng)48 h。
生長曲線：按5%（V/V）的接種量將不同菌株的種子液分別接種于液體篩選培養(yǎng)基，34℃條件下嚴(yán)格厭氧培養(yǎng)，每8 h取出8 mL培養(yǎng)液，采用紫外分光光度計(jì)在波長660 nm處測定吸光度值（OD660nm值）。
生長溫度：按5%（V/V）的接種量將不同菌株的種子液分別接種于液體篩選培養(yǎng)基，分別置于20℃、30℃、34℃、37℃、41℃、45℃和60℃條件下嚴(yán)格厭氧培養(yǎng)48 h。
生長pH值：按5%（V/V）的接種量將不同菌株的種子液分別接種于不同pH值（2～10）的液體篩選培養(yǎng)基，34℃條件下嚴(yán)格厭氧培養(yǎng)48 h。
乙醇耐受性：按5%（V/V）的接種量將不同菌株的種子液分別接種于乙醇體積分?jǐn)?shù)不同（2%～23%）的液體篩選培養(yǎng)基，34℃條件下嚴(yán)格厭氧培養(yǎng)48 h。
以上試驗(yàn)分別取8 mL發(fā)酵液，測定OD660nm值，且均以未接種的培養(yǎng)基為空白對(duì)照。
1.3.5窖泥中酯化菌的鑒定
形態(tài)觀察及生理生化試驗(yàn)：根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》對(duì)篩選的目的菌株選擇性地進(jìn)行形態(tài)觀察和生理生化鑒定。
分子生物學(xué)鑒定：提取目的菌株的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA），以其為模板，采用細(xì)菌通用引物27F、1492r對(duì)目的菌株的16S rDNA基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物委托上海美吉公司進(jìn)行測序。將測序結(jié)果提交至美國國家生物信息中心（national center for biotechnologyinformation，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast同源性比對(duì)搜索，選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA基因序列，采用MEGA 6.0軟件的鄰接（neighbor joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。
1.3.6酯類物質(zhì)的檢測
取5 mL富集液或發(fā)酵液于頂空瓶中，再加入2 g NaCl和0.25 mL乙酸正丁酯（0.2 mg/mL）作為內(nèi)標(biāo)，混勻，置于55℃固相微萃取儀中平衡15 min后，插入萃取針頭萃取30 min，進(jìn)行GC-MS檢測。質(zhì)譜圖通過與美國Agilent公司提供的美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（national institute of standards and technology，NIST）05a.L標(biāo)準(zhǔn)譜庫進(jìn)行比對(duì)，利用匹配度均＞800的特征離子進(jìn)行定性分析；采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行半定量。
1.3.7數(shù)據(jù)分析
結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。利用SPSS19.0軟件進(jìn)行方差分析，采用Origin 8.0軟件作圖。
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