白色念珠菌(Candida albicans)，是一種重要的條件致病真菌，通常存在于鴿子的上消化道，一般在正常機體中數(shù)量少，不引起疾病，但當機體免疫功能或一般防御力下降或正常菌群結(jié)構(gòu)失調(diào)時會轉(zhuǎn)變?yōu)橹虏【?，對鴿子造成危害，尤其是乳鴿感染的幾率特別大。本病俗稱鵝口瘡，又稱霉菌性口炎、念珠菌口炎、酸臭嗉囊病和念珠菌病，顯著特征是病鴿食道和嗉囊的黏膜上產(chǎn)生黃白色的干酪樣假膜，剝離假膜后可見糜爛和潰瘍。當乳鴿感染白色念珠菌后，通常在下窩前一般無明顯癥狀，下窩后癥狀明顯，嗉囊會出現(xiàn)明顯的干硬，精神沉郁，羽毛松亂，不愿走動，食欲減少甚至廢絕，生長不良，消瘦，并且容易繼發(fā)毛滴蟲病、細菌感染，如文獻報道，白色念珠菌嘗嘗繼發(fā)或與金黃色葡萄球菌共感染，最終只能成為殘次鴿。目前，在獸醫(yī)臨床，尚無有效的治療藥物針對白色念珠菌的感染或白色念珠菌造成的復合感染。
小檗堿，也叫黃連素，原是從中藥川芍中提取的生物堿，目前可在多種草本植物中提取或人工合成，化學結(jié)構(gòu)為四甲基吡嗪，已被證實具有多種生物學功能，包括抗炎、抗氧化、抗微生物、免疫調(diào)控、控制血糖、心血管保護等功能，臨床上常常用于治療腹瀉、糖尿病及心血管等疾病，小檗堿對感染性腹瀉的治療具有較好的效果，臨床上用藥形式主要為鹽酸小檗堿或硫酸小檗堿。同時，一些體外研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿也具有一定的抗菌活性，其中對革蘭氏陰性菌的抗菌活性較弱，最小抑菌濃度(MIC)在512-1024μg/mL范圍，對革蘭氏陽性菌的抗菌活性較強，最小抑菌濃度(MIC)通常在128-512μg/mL之間(夏帥，馬立艷，謝苗榮.鹽酸小檗堿對金黃色葡萄球菌體外抗菌活性的研究[J].臨床和實驗醫(yī)學雜志，2022，21(07):673-678)；此外，小檗堿對真菌感染也具有一定的治療效果，如研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿對白色念珠菌具有一定的活性，MIC一般在64-128μg/mL之間(雍江堰，王海，黃筱雪等.鹽酸小檗堿與氟康唑聯(lián)用對耐藥白色念珠菌鈣穩(wěn)態(tài)的影響[J].中國病原生物學雜志，2020，15(08):903-909)，對抗新生隱球菌活性的MIC范圍在8-168μg/mL之間(徐佳龍，宋浩雷，陳曉琴等.小檗堿抗新生隱球菌活性和作用機制[J].微生物學報，2023，63(04):1541-1550.)。
SU3327(又稱halicin、海立信，CAS No.:40045-50-9)是一種C-JUN的N末端激酶抑制劑，結(jié)構(gòu)見圖1。SU3327是一種有效的，選擇性的且具有底物競爭性的JNK抑制劑，IC50為0.7μM。SU3327還以IC50值為239nM抑制JNK和JIP之間的蛋白相互作用。SU3327對p38α和Akt激酶的活性較低。先前的研究發(fā)現(xiàn)SU3327是一種潛在的抗糖尿病藥物。另一文獻已經(jīng)報道，SU3327表現(xiàn)出一定的抗菌活性，對腸球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等臨床常見病原菌具有一定的抗菌活性。
實驗中所用小檗堿為小檗堿鹽酸鹽形式，即鹽酸小檗堿，CAS號:633-65-8，分子式：C20H18ClNO4，分子量:372.82，購買于阿拉丁試劑公司，純度≥98％。SU3327購買自美國MCE試劑公司，純度≥99％。稱取一定量的鹽酸小檗堿配置成母液濃度為128mg/mL水溶液。SU3327使用DMSO配置成母液濃度為40mg/mL濃度的母液。所有母液制備好后儲存在-20度冰箱。
下述實驗中所用的病原菌：
耐甲氧西林金黃色葡萄球菌ATCC 33591(MRSA33591)由國家獸藥安全評價中心(北京)提供。
白色念珠菌標準指控菌ATCC12301購買于上海復祥生物科技公司。
下述實驗中使用細菌培養(yǎng)基：
YPD培養(yǎng)基：先用電子天平稱取20g葡萄糖、10g酵母提取物、20g胰化蛋白胨，再加入800mL去離子水，在磁力攪拌器上使固體完全溶解后，再用去離子水定容至1L，分裝在錐形瓶內(nèi)，若配制固體培養(yǎng)基，則按照需要加入2％的瓊脂，并用高壓滅菌鍋進行120℃、30min滅菌后，放置常溫備用。
MHB肉湯培養(yǎng)基購自北京陸橋技術股份有限公司，配制方法如下：稱取25.0g于1L蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，121℃高壓滅菌15min，備用。
液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(FTG)成分(g/L)：胰蛋白胨15.0g/L，酵母粉5.0g/L，硫乙醇酸鈉0.5g/L，葡萄糖5.0g/L，氯化鈉2.5g/L，L-胱氨酸0.5g/L，刃天青0.001g/L，瓊脂0.75g/L。
MHA培養(yǎng)基購自北京陸橋技術股份有限公司，配制方法如下：稱取38.0g于1L蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，121℃高壓滅菌15min，冷至55℃傾注平板備用。
腦心浸液培養(yǎng)基(BHI)購自北京陸橋技術股份有限公司，配制方法如下：稱取本品38.5g，加熱攪拌溶解于1000mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至7.3，121℃高壓滅菌15分鐘，備用。
BHI固體培養(yǎng)基購自北京路橋技術股份有限公司，配制方法如下：稱取本品50.0g于1000mL蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，121℃高壓滅菌20min，冷卻至55℃傾注平板備用。
SU3327和小檗堿聯(lián)合使用對白色念珠菌的協(xié)同抑制作用
SU3327和鹽酸小檗堿聯(lián)合使用對病原菌的聯(lián)合用藥指數(shù)(FICI)測定：使用棋盤法測定SU3327和鹽酸小檗堿聯(lián)合應用對白色念珠菌標準指控菌株ATCC12301菌株的FICI值。具體操作如下：使用棋盤肉湯稀釋法測定不同藥物之間的FICI。挑取真菌單菌落于沙氏葡萄糖肉湯中，在27℃培養(yǎng)真菌48h。用麥氏比濁儀調(diào)節(jié)真菌濁度至麥氏比濁度0.5，并用沙氏葡萄糖培養(yǎng)基稀釋至1.0×103CFUs/mL后備用。在96孔U型板中加入100μL沙氏葡萄糖培養(yǎng)基，將相應濃度的藥物加入第八行前10個孔中，依次向上倍比稀釋至第二行。在第一列各孔加入其它待測藥物，依次從左向右倍比稀釋至第九列。1-10列均加入100μL稀釋好的待測菌液。第11列和第12列分別為只含有沙氏葡萄糖培養(yǎng)基和含有待測菌液的陰性、陽性對照。將96孔板置于27℃靜置培養(yǎng)24h后，讀取結(jié)果，以肉眼能分辨的抑制真菌生長的最低藥物濃度為該藥物的MIC值。
FICI＝MIC(A藥聯(lián)合)/MIC(A藥單用)+MIC(B藥聯(lián)合)/MIC(B藥單用)，判斷標準：FICI≤0.5，協(xié)同作用；0.5＜FICI≤1，相加作用；1﹤FICI≤2，無關作用；FICI＞2，拮抗作用。即：SU3327和小檗堿的FICI＝MIC(小檗堿聯(lián)合)/MIC(小檗堿單用)+MIC(SU3327聯(lián)合)/MIC(SU3327單用)。
結(jié)果如下所示：
圖2所示，SU3327和鹽酸小檗堿單獨使用對ATCC12301的MIC分別為40μg/mL和128μg/mL，按照棋盤法獲得協(xié)同效果的最佳配比計算，SU3327和小檗堿的MIC分別降低至2.5μg/mL和16μg/mL(即SU3327和)，協(xié)同指數(shù)FICI為0.1875，其中，按照棋盤法結(jié)果，SU3327與鹽酸小檗堿質(zhì)量比為(1.25-10):(2-16)的范圍均具有協(xié)同作用，即相當于SU3327與鹽酸小檗堿質(zhì)量比為(1.25-10):(1.8-14.4)，表明SU3327和小檗堿聯(lián)合使用對白色念珠菌具有明顯的協(xié)同抗菌活性。
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