2結(jié)果
2.1重組質(zhì)粒pJL23-cglⅠ在鈍齒棒桿菌中的分離穩(wěn)定性
重組鈍齒棒桿菌在無(wú)卡那霉素抗性選擇壓力的條件下,在LB固體平板上連續(xù)傳代100次,每隔10代次檢測(cè)1次質(zhì)粒丟失情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,重組質(zhì)粒pJL23-cglⅠ在重組鈍齒棒桿菌中未見(jiàn)明顯丟失現(xiàn)象(見(jiàn)表1)。
表1重組質(zhì)粒pJL23-cglⅠ在鈍齒棒桿菌中的分離穩(wěn)定性
2.2重組質(zhì)粒pJL23-cglⅠ在鈍齒棒桿菌中的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性
表2重組鈍齒棒桿菌在不同傳代次數(shù)中的噬菌體抗性(EOP)
取傳代次數(shù)分別為原代、20、40、60、80、100次的重組鈍齒棒桿菌進(jìn)行噬菌體抗性定量檢測(cè),通過(guò)噬菌體感染實(shí)驗(yàn)分析cglⅠ基因在傳代過(guò)程中是否正常表達(dá),以此考察重組質(zhì)粒pJL23-cglⅠ在鈍齒棒桿菌中的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。由表2可以看出,重組鈍齒棒桿菌在傳代過(guò)程中一直保持抗噬菌體活性,與原代菌株相比,EOP均小于10-8。表明cglⅠ基因在重組鈍齒棒桿菌株中穩(wěn)定表達(dá),即在傳代培養(yǎng)過(guò)程中,重組質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。
2.3重組質(zhì)粒pJL23-cglⅠ對(duì)鈍齒棒桿菌生長(zhǎng)的影響
從野生鈍齒棒桿菌和重組鈍齒棒桿菌的生長(zhǎng)曲線可以看出(見(jiàn)圖1),在相同培養(yǎng)條件下,野生鈍齒棒桿菌培養(yǎng)到3 h左右便達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,而重組鈍齒棒桿菌達(dá)到對(duì)數(shù)期的時(shí)間約延遲1 h左右,但二者達(dá)到穩(wěn)定期的時(shí)間趨于相同?？傮w上2個(gè)菌株的生長(zhǎng)率相差不大,只是重組鈍齒棒桿菌進(jìn)入對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)速度要略晚于野生鈍齒棒桿菌。
圖1野生鈍齒棒桿菌和重組鈍齒棒桿菌的生長(zhǎng)曲線
2.4重組質(zhì)粒pJL23-cglⅠ對(duì)鈍齒棒桿菌產(chǎn)生谷氨酸的影響
由圖2可以看出,重組鈍齒棒桿菌和野生鈍齒棒桿菌在發(fā)酵過(guò)程中谷氨酸積累量的變化趨勢(shì)基本一致,具有相同的谷氨酸積累高峰,即在發(fā)酵32 h有最大的谷氨酸積累量,分別為277.74 mg/L和261.39 mg/L,表明重組質(zhì)粒pJL23-cglⅠ的導(dǎo)入并未影響鈍齒棒桿菌的代謝產(chǎn)酸量。
圖2谷氨酸產(chǎn)生動(dòng)力學(xué)曲線
3討論
對(duì)重組鈍齒棒桿菌質(zhì)粒穩(wěn)定性的研究結(jié)果表明,重組菌株連續(xù)傳100代次后,沒(méi)有發(fā)生質(zhì)粒丟失現(xiàn)象,且仍具有原代菌株的功能活性,表明重組菌株中的質(zhì)粒具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和分離穩(wěn)定性,推測(cè)重組質(zhì)粒穩(wěn)定性可能與質(zhì)粒上攜帶的RM系統(tǒng)cglⅠ基因復(fù)合體有關(guān)。報(bào)道表明,一些Ⅱ型RM基因系統(tǒng)具有分離后殺死活性,可以介導(dǎo)維持質(zhì)粒穩(wěn)定性[8-11]。正常情況下,細(xì)胞中的M酶保護(hù)宿主染色體免遭R酶的致死性裂解。然而,一旦RM基因系統(tǒng)從細(xì)胞中被根除,隨著細(xì)胞分裂,由于稀釋,子代細(xì)胞中含有的M酶將越來(lái)越少,結(jié)果是M酶保護(hù)新復(fù)制的染色體上的許多識(shí)別位點(diǎn)的能力漸漸減弱。這樣,染色體DNA上未被甲基化的位點(diǎn)將受到攻擊,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。同樣,RM基因系統(tǒng)丟失后,隨著細(xì)胞分裂,R酶也將被稀釋。然而,M酶和R酶在作用方式上存在不平衡,也就是說(shuō),R酶殺死細(xì)胞時(shí),只需染色體上一處斷裂就可以充分有效(除非DNA被修復(fù)),而對(duì)于M酶而言,對(duì)宿主的保護(hù),則需要染色體上上百個(gè)識(shí)別位點(diǎn)被甲基化[12]。雖然推測(cè)重組菌株的質(zhì)粒穩(wěn)定性與質(zhì)粒上攜帶的RM基因復(fù)合體有關(guān),但其確切原因和機(jī)制還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。
cglⅠ基因復(fù)合體在鈍齒棒桿菌中表達(dá)后,首先通過(guò)甲基轉(zhuǎn)移酶在特異識(shí)別序列上使宿主基因組DNA胞嘧啶甲基化,以避免相應(yīng)限制酶的裂解。這樣,宿主基因組DNA胞嘧啶被甲基化后,是否對(duì)重組棒桿菌的生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生影響尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,重組菌株達(dá)到對(duì)數(shù)期時(shí)間略晚于野生菌株,表明重組菌株對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)有些緩慢,但進(jìn)入穩(wěn)定期后兩者趨于一致。分析原因可能有以下幾方面:①重組質(zhì)粒在宿主菌中復(fù)制、外源基因產(chǎn)物的表達(dá)增加了細(xì)菌細(xì)胞的代謝壓力;②含有質(zhì)粒的重組菌株需要更多的能量和營(yíng)養(yǎng)合成更多的DNA、RNA和蛋白質(zhì)等物質(zhì);③質(zhì)粒的復(fù)制和表達(dá)也將與宿主細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)可用的原料物質(zhì),從而影響細(xì)菌的生長(zhǎng)速率[13-14]。
重組鈍齒棒桿菌產(chǎn)生谷氨酸的研究結(jié)果表明,重組菌株和野生菌株在實(shí)驗(yàn)發(fā)酵過(guò)程中谷氨酸積累量的變化基本趨于一致,表明重組質(zhì)粒的導(dǎo)入并未影響菌株的代謝產(chǎn)酸量。
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