《中國(guó)獸藥典》二〇一〇年版三部規(guī)定支原體培養(yǎng)基制成后需進(jìn)行質(zhì)控檢驗(yàn)，合格后方可用于生物制品的支原體檢驗(yàn)[1]。用于質(zhì)控檢驗(yàn)的質(zhì)控菌株分別為滑液支原體(CVCC2960)和豬鼻支原體(CVCC361)?；褐гw用于改良Frey氏液體培養(yǎng)基、改良Frey氏固體培養(yǎng)基的質(zhì)控檢驗(yàn);豬鼻支原體用于支原體液體培養(yǎng)基、支原體固體培養(yǎng)基、無(wú)血清支原體培養(yǎng)基的質(zhì)控檢驗(yàn)。為了解兩種質(zhì)控菌株的生長(zhǎng)繁殖特性，本試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定兩種菌株在不同培養(yǎng)時(shí)段的CCU(color change unit，CCU)，繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)并確定世代時(shí)間，為支原體檢驗(yàn)用培養(yǎng)基的質(zhì)控檢驗(yàn)提供數(shù)據(jù)參考。
生長(zhǎng)曲線(xiàn)繪制
從0 h開(kāi)始，每隔6 h從待測(cè)菌液中取樣，采用10倍系列稀釋計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)。具體方法是:將培養(yǎng)基分裝成每管1.8 mL，第1管加入待測(cè)菌液0.2 mL，混勻后，取0.2 mL加入第2管中，再混勻，取0.2 mL加入到第3管中，依此操作一直至第10管，將第10管中混勻后取0.2 mL棄去。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣3份，將試管置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，試驗(yàn)設(shè)未接種菌液的培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照。每天觀察試管培養(yǎng)基顏色變化，直至培養(yǎng)基顏色不再變化時(shí)，結(jié)束觀察。判定滴度:以培養(yǎng)基顏色變化的最高稀釋度作為待測(cè)菌液的生長(zhǎng)滴度，即CCU表示[2]。用3份樣品的平均CCU，n=3)表示該時(shí)間點(diǎn)支原體CCU。以取樣時(shí)間點(diǎn)為橫坐標(biāo)，平均CCU的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。
世代時(shí)間的計(jì)算
世代時(shí)間(generation time)[3]，即菌體每繁殖一代所需的時(shí)間，用G表示。分別取滑液支原體、豬鼻支原體生長(zhǎng)曲線(xiàn)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中的一段，按如下公式計(jì)算世代時(shí)間:
式中，G為世代時(shí)間，t為培養(yǎng)時(shí)間，Mo為開(kāi)始時(shí)的活菌數(shù)，Mt為經(jīng)t時(shí)間培養(yǎng)后的活菌數(shù)。
質(zhì)控菌株的生長(zhǎng)曲線(xiàn)圖
從圖1可知，滑液支原體菌株在接種后6 h內(nèi)為遲緩期，6～36 h為對(duì)數(shù)期，36～54 h為穩(wěn)定期，54 h之后為衰老期。從圖2可知，豬鼻支原體菌株在接種后6 h內(nèi)是遲緩期，6～18 h為對(duì)數(shù)期，18～126 h為穩(wěn)定期，126 h之后為衰老期。
質(zhì)控菌株的世代時(shí)間
滑液支原體對(duì)數(shù)期在6～36 h，t1=12 h，t2=30 h，代入公式，滑液支原體世代時(shí)間G=231.8 min;豬鼻支原體對(duì)數(shù)期在6～18 h，t1=6 h，t2=18 h，代入公式，豬鼻支原體世代時(shí)間G=117.1 min。
結(jié)論
支原體是一類(lèi)缺乏細(xì)胞壁的原核微生物，它在液體培養(yǎng)基的生長(zhǎng)曲線(xiàn)與細(xì)菌相同，可分為遲緩期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期、衰老期[4]。為保證質(zhì)控菌株生長(zhǎng)穩(wěn)定，菌株培養(yǎng)后每次傳代，均按照豬鼻支原體3%、滑液支原體5%的比例接種培養(yǎng)基，且每次傳代培養(yǎng)均在108CCU/mL數(shù)量級(jí)收獲菌液。從兩個(gè)質(zhì)控菌株生長(zhǎng)曲線(xiàn)圖分析，滑液支原體菌株最佳收獲時(shí)間在培養(yǎng)后36～54 h，豬鼻支原體菌株最佳收獲時(shí)間在培養(yǎng)后18～126 h，在此時(shí)段內(nèi)收獲的菌液，其CCU均維持在108～109CCU/mL數(shù)量級(jí)。但在研究中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)時(shí)間相差6～12 h的支原體菌液顏色幾乎沒(méi)有差別，而CCU卻相差1～2個(gè)數(shù)量級(jí)，這就提示在培養(yǎng)菌液過(guò)程中，把握好收獲時(shí)間至關(guān)重要。如果質(zhì)控菌株不在穩(wěn)定期中收獲，可能導(dǎo)致菌液滴度不夠高，即使使用的是合格的培養(yǎng)基，滴度也達(dá)不到合格的標(biāo)準(zhǔn)。所以，本研究提示在穩(wěn)定期及時(shí)收獲菌液、及時(shí)保存，才能保證支原體檢驗(yàn)培養(yǎng)基質(zhì)控菌株滴度的穩(wěn)定和均一，保證支原體培養(yǎng)基檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確。
培養(yǎng)基質(zhì)量直接影響生物制品檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，所以質(zhì)控菌株作為一個(gè)衡量培養(yǎng)基合格與否的標(biāo)尺，更是起到了至關(guān)重要的作用。目前，現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》在質(zhì)控菌株標(biāo)準(zhǔn)化方面還沒(méi)有十分具體的規(guī)定。雖然試驗(yàn)初次通過(guò)繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)和確定世代時(shí)間來(lái)探索質(zhì)控菌株的生長(zhǎng)規(guī)律，為培養(yǎng)基檢驗(yàn)及質(zhì)控菌株的使用提供了一定的數(shù)據(jù)參考，但是質(zhì)控菌株的標(biāo)準(zhǔn)化工作還需大量試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，例如質(zhì)控菌株的傳代次數(shù)、菌液接種培養(yǎng)基的適宜比例、生長(zhǎng)滴度變化等方面還需進(jìn)一步確證并作詳細(xì)規(guī)定。另外，在質(zhì)控菌株培養(yǎng)方面，傳統(tǒng)上一直采用肉眼觀察的方式對(duì)培養(yǎng)液顏色進(jìn)行判斷，試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)此方法準(zhǔn)確性不高，且不同試驗(yàn)人員判斷亦存在差異，建議采用酸度計(jì)測(cè)定取代肉眼觀察方法，使試驗(yàn)結(jié)果更可信。
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