水稻是世界第二大糧食作物，在我國糧食生產(chǎn)中占據(jù)重要地位，細(xì)菌病害是制約水稻種植的主要因素。水稻白葉枯病(bacterial leaf blight of rice，BLB)是影響水稻產(chǎn)量最嚴(yán)重的三大細(xì)菌性病害之一，又稱過火風(fēng)、白葉瘟。水稻白葉枯病分布廣泛，于1884年在日本發(fā)現(xiàn)，之后在包括中國、泰國、印度尼西亞等亞洲以及大洋洲、美洲、非洲等水稻種植地區(qū)均有發(fā)現(xiàn)。黃單胞菌是一種革蘭氏陰性菌，它具有2個致病變種，其中水稻黃單胞菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo)是引起水稻白葉枯病的病原菌。水稻白葉枯病主要危害葉片，一般先從葉尖或葉緣開始侵入，在葉片上形成黃綠或暗綠色斑點(diǎn)，繼而擴(kuò)展為水漬狀短條斑，再變成灰白色，最后呈干枯脫水狀。該病若發(fā)生在抽穗期，則會導(dǎo)致水稻粒重減少，結(jié)實(shí)率下降，使水稻減產(chǎn)10%~30%，嚴(yán)重時甚至減產(chǎn)50%以上，給我國糧食安全造成巨大威脅。水稻白葉枯病的防治一般分為農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治、生物防治等?；瘜W(xué)防治是防治病蟲害最經(jīng)濟(jì)有效的措施。20世紀(jì)80年代主要使用葉枯唑等化學(xué)藥劑來防治水稻白葉枯病，由于長期連續(xù)使用，其藥效明顯下降，已于2016年11月停用。目前國內(nèi)登記在冊用于防治白葉枯病的藥劑僅有噻唑類化合物。此外常見的Cu2+殺菌劑和抗生素等也具有藥效差、植物毒性高和容易產(chǎn)生耐藥性等缺點(diǎn)。因此化學(xué)藥劑防治效果欠佳，公眾迫切需要尋找一種有效的殺菌劑以應(yīng)對水稻白葉枯病。噬菌體憑借其宿主特異性、安全高效等優(yōu)勢逐漸成為了新型抗菌劑的研究熱點(diǎn)之一。
噬菌體是一種能夠侵染細(xì)菌的病毒，廣泛存在于各個地方，是地球上最豐富的生物體。根據(jù)生活史不同，噬菌體分為溫和噬菌體和烈性噬菌體。烈性噬菌體通過吸附、侵入、增殖、裝配和裂解5個階段殺滅病原菌。相較于抗生素，烈性噬菌體具有宿主特異性、不影響其他微生物群落正常生長、安全高效等優(yōu)勢，被認(rèn)為是一種綠色天然的抗生素替代物。1919年，?aczek等發(fā)現(xiàn)噬菌體并利用其成功治愈了痢疾，噬菌體療法開始萌芽并迅速得到發(fā)展;然而隨著20世紀(jì)40年代抗生素的發(fā)明，噬菌體研究陷入了停滯。直至21世紀(jì)初，抗生素過度使用導(dǎo)致多重耐藥細(xì)菌的出現(xiàn)，世界公共衛(wèi)生安全受到威脅，噬菌體才重新得到關(guān)注。近年來，噬菌體研究不斷深入發(fā)展，在農(nóng)業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖、食品等領(lǐng)域均取得不少成果。使用噬菌體VPp1對感染副溶血性弧菌的牡蠣進(jìn)行除菌，比工廠使用臭氧凈化效果更好;利用噬菌體以防御造成馬鈴薯軟腐病的歐文氏桿菌，能夠?qū)︸R鈴薯的貯藏起到保護(hù)作用。2006年，隨著首個噬菌體產(chǎn)品ListShield作為食品添加劑通過了美國食品和藥物管理局(FDA)的審批，至今已有多個噬菌體產(chǎn)品成功上市，可見噬菌體在防控細(xì)菌感染方面表現(xiàn)出了巨大應(yīng)用潛力。
目前關(guān)于使用噬菌體防治白葉枯病的報道較少。劉錦將從土壤中分離得到黃單胞菌噬菌體Xoo_sp13、Xoo_sp14、Xoo_sp15制成雞尾酒制劑，能使水稻中PXO99A菌株下降2個數(shù)量級。Liu等分離得到的2株廣譜噬菌體pXoo2106和pXoo2107單獨(dú)或組合使用均可有效抑制Xoo在體外的生長。Jain等研究表明，噬菌體vB_XooS_NR08在水稻盆栽試驗(yàn)中，添加噬菌體減少了90.23%和79.27%的白葉枯病菌。Jiang等報道，黃單胞菌噬菌體J2、J3和E混合使用能有效降低64.30%的白葉枯病害指數(shù)。Ogunyemi等在接種黃單胞菌前后給水稻噴施噬菌體X3均能顯著降低白葉枯病發(fā)病率，且其用于種子消毒也非常有效。為豐富黃單胞噬菌體資源庫，本研究使用黃單胞菌Xoo 2068作為宿主，從稻蝦田水中分離得到一株能裂解水稻黃單胞菌的噬菌體，并對其全基因組、生物學(xué)特性和體外抑菌能力等進(jìn)行相關(guān)研究，以期為噬菌體應(yīng)用于防治水稻白葉枯病提供參考。
1材料與方法
1.1試驗(yàn)材料
1.1.1菌株及樣品來源
本研究所使用的17株白葉枯病菌(表1)由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。在廣東省廣州市南沙區(qū)大崗鎮(zhèn)下坦村水稻種植基地的稻蝦田中采集水樣5 L用于噬菌體分離。
表1噬菌體HDB2的宿主譜
+: 噬菌體能感染該菌株, -: 噬菌體不能感染該菌株?！?”表示噬菌斑大小在5 mm以下, “++”表示噬菌斑大小在5~8 mm之間, “+++”表示噬菌斑大小在8~10 mm之間, “+++++”表示噬菌斑大小大于10 mm。
1.1.2主要試劑
營養(yǎng)肉湯(nutrient broth)培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂(nutrient agar)培養(yǎng)基、技術(shù)瓊脂、牛肉膏提取物，購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;硫酸鎂、氯化鈉、氫氧化鈉、吐溫80、氯化鈣、三氯甲烷、異丙醇、異戊醇、無水乙醇，購于上海滬試化工有限公司;PEG-8000、SM Buffer、Tris飽和酚溶液、EcoR I、BamH I、Hind III、瓊脂糖、Gold View核酸染料、DNA Marker，購于生工生物工程(上海)股份有限公司;DNase I、RNase A、蛋白酶K、十二烷基硫酸鈉(SDS)、乙二胺四乙酸(EDTA)，購于廣州怡和生物科技有限公司;氯化銫購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
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