1材料與方法
1.1材料與試劑
大腸桿菌ATCC 25922菌株保存于華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院。龍腦精油由廣東華清園生物科技股份有限公司提供。
LB肉湯培養(yǎng)基和技術(shù)瓊脂粉，廣東環(huán)凱微生物科技公司生產(chǎn)；二甲基亞砜（AR級），上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司生產(chǎn)；結(jié)晶紫（AR級），天津市大茂化學(xué)試劑廠生產(chǎn)；氯化鈉（AR級），上海阿拉丁生化科技股份有限公司生產(chǎn)；D-無水葡萄糖（AR級），上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司生產(chǎn)；蛋白胨（AR級），英國Oxoid公司生產(chǎn)。
1.2儀器與設(shè)備
二級分子蒸餾設(shè)備MDS80-Ⅱ，廣州浩立生物科技有限公司生產(chǎn)；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀Agilent 8890-7000 D，安捷倫科技有限公司生產(chǎn)；數(shù)顯恒溫?fù)u床，常州澳華儀器有限公司生產(chǎn)；恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；全自動微生物生長曲線分析儀，Bioscreen C 公司生產(chǎn)。
1.3方法
1.3.1龍腦精油的切割分離及成分分析
取龍腦精油原油加入進(jìn)料瓶，在蒸餾溫度80℃，真空度400 Pa、刮膜速度250 r/min下，分別收集輕組分和重組分。
采用正己烷作溶劑，精油樣品質(zhì)量濃度約為300μg/mL，用過量無水硫酸鈉除水（靜置8 h以上），用0.22μm有機系濾膜過濾制得液態(tài)精油樣品。安捷倫色譜瓶裝1 mL樣品進(jìn)行GC-MS檢測。
GC條件：HP-5MS彈性石英毛細(xì)柱管（30 m×0.25 mm×0.25μm）。分流比為20∶1，進(jìn)樣量1μL，載氣為He，流速1.0 mL/min。升溫程序：進(jìn)樣口溫度250℃，起始溫度50℃，保持1 min，升溫速率5℃/min，升至250℃，保持10 min。
MS條件：電子轟擊離子源（EI）接口溫度280℃，離子源溫度230℃，發(fā)射電流100μA，電子能量70 eV，檢測器電壓1 000 V，溶劑延時8 min，掃描質(zhì)量范圍33~450 u。
根據(jù)上述GC條件和MS條件對樣品進(jìn)行GC-MS分析，得到龍腦精油原油、輕組分和重組分的總離子流圖；對應(yīng)的質(zhì)譜圖經(jīng)美國NIST 14.L標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫檢索及人工解析確定各化學(xué)成分，將峰面積歸一化計算精油中各化合物的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)。
1.3.2龍腦精油溶液的制備
將3種不同組分的龍腦精油分別按照體積比1∶1的比例溶解在二甲基亞砜（DMSO）中，用0.22μm的有機膜過濾除菌，裝于棕色玻璃瓶密封備用。
1.3.3細(xì)菌的活化
從4℃冰箱中取出冷凍保存的大腸桿菌ATCC 25922，挑取單菌落劃線培養(yǎng)于LB瓊脂培養(yǎng)基中。置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h后，挑取平板中的單菌落接于裝有2 mL LB液體培養(yǎng)基的搖菌管中，在37℃、200 r/min的氣浴恒溫振蕩器上過夜培養(yǎng)。培養(yǎng)后的菌懸液置于4℃冰箱中備用。
1.3.4最小抑菌濃度與最小殺菌濃度的測定
本實驗采用二倍稀釋法測定龍腦精油對大腸桿菌的最低抑菌濃度。將3種不同組分的龍腦精油分別都按照體積比1∶1的比例溶解在DMSO中，用0.22μm的有機膜過濾除菌，再加入滅過菌的LB肉湯，得到體積分?jǐn)?shù)為10%的原油、輕組分、重組分精油溶液。將上述溶液取200μL加入96孔板的第1列，再往第2到7列的孔各加入100μL，從第1列的孔中取出100μL溶液加入第2列中，依次進(jìn)行二倍稀釋，最后1列吸出100μL溶液；接著在每孔中加入100μL過夜培養(yǎng)稀釋100倍后的菌懸液，最后原油、輕組分、重組分精油溶液濃度依次為50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5、0.781 25μL/mL。設(shè)置LB肉湯為陰性對照組，每個樣品做3個平行。將96孔板在37℃靜置培養(yǎng)24 h，以不發(fā)生渾濁變化且與空白對照無明顯差異的濃度作為龍腦精油對大腸桿菌的最低抑菌濃度。
取上述肉眼觀察無明顯渾濁的濃度及前后兩個濃度的菌液各100μL均勻涂布于LB瓊脂平板中，在37℃下倒置培養(yǎng)24 h，觀察平板中菌落的生長情況。菌落數(shù)不超過5個的精油濃度即為最低殺菌濃度，每個樣品做3個平行。
1.3.5大腸桿菌生長曲線的測定
將不同組分龍腦精油溶液分別加入菌懸液中調(diào)整其終濃度為最低抑菌濃度（MIC）和1/4 MIC，無龍腦精油處理的菌懸液為對照組。在37℃、200 r/min的搖床上培養(yǎng)，每2 h取200μL于新的透明96孔酶標(biāo)板中，利用全自動微生物生長曲線分析儀測定D（600），連續(xù)測14 h，每個樣品做3個平行。
1.3.6大腸桿菌泳動與叢動實驗
在裝有300 mL蒸餾水的錐形瓶中加入3.0 g胰蛋白胨、1.5 g氯化鈉和0.9 g瓊脂粉末，攪拌均勻至液體澄清，封上封口膜后置于高壓滅菌鍋，在121℃、101 kPa條件下滅菌15 min，待其冷卻至50~60℃，倒入平板制成泳動培養(yǎng)基。
在裝有300 mL蒸餾水的錐形瓶中加入2.4 g胰蛋白胨、2.4 g氯化鈉、1.2 g酵母提取物、1.5 g葡萄糖和1.5 g瓊脂粉末，攪拌均勻至液體澄清，封上封口膜后置于高壓滅菌鍋，在121℃、101 kPa條件下滅菌15 min，待其冷卻至50~60℃，倒入平板制成叢動培養(yǎng)基。
在泳動培養(yǎng)基約60℃時分別加入3種龍腦精油溶液，充分混勻，調(diào)配至濃度為MIC、1/2 MIC和1/4 MIC，同時設(shè)置無龍腦精油的泳動培養(yǎng)基為對照組，每個培養(yǎng)皿倒入約15 mL泳動培養(yǎng)基，待泳動培養(yǎng)基凝固后，風(fēng)干培養(yǎng)基表面的水分。將5μL處于對數(shù)生長期的菌液滴在平板中心，待瓊脂吸干菌液后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h。每個濃度設(shè)置3個平行，待培養(yǎng)結(jié)束后觀察并用十字交叉法測量以接種點為中心的細(xì)菌泳動圈的大小。
在叢動培養(yǎng)基約60℃時分別加入3種龍腦精油溶液，充分混勻，調(diào)配至濃度為MIC、1/2 MIC和1/4 MIC，同時設(shè)置無龍腦精油的叢動培養(yǎng)基為對照組，每個培養(yǎng)皿倒入約15 mL叢動培養(yǎng)基，待叢動培養(yǎng)基凝固后，風(fēng)干培養(yǎng)基表面的水分。將5μL處于對數(shù)生長期的菌液刺入平板中心，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h。每個濃度設(shè)置3個平行，待培養(yǎng)結(jié)束后觀察并用十字交叉法測量以接種點為中心的細(xì)菌叢動圈的大小。
大腸桿菌泳動和叢動的抑制率計算公式為
泳動或叢動能力抑制率=（S1?S2）/S1×100%
式中：S1為對照組的細(xì)菌泳動圈或叢動圈的面積，mm2；S2為實驗組的細(xì)菌泳動圈或叢動圈的面積，mm2。
1.3.7大腸桿菌生物被膜的測定
本實驗采用結(jié)晶紫染色法測定龍腦精油對大腸桿菌的被膜生長能力。首先在96孔板中將龍腦精油溶液取200μL加入96孔板的第1列，再往第2到4列的孔各加入100μL，從第1列的孔中取出100μL溶液加入第2列中，依次進(jìn)行二倍稀釋，最后一列吸出100μL溶液，最后在每孔中加入100μL過夜培養(yǎng)稀釋100倍后的菌懸液。原油、輕組分、重組分精油溶液濃度依次為6.25、3.125、1.562 5、0.781 25μL/mL，設(shè)置不加龍腦精油溶液的LB肉湯為陰性對照組，將96孔板在37℃靜置培養(yǎng)24 h。
培養(yǎng)結(jié)束后倒去96孔板中的細(xì)菌懸濁液，用200μL的磷酸鹽緩沖液（PBS）對每孔洗滌3次，洗去孔中的浮游菌后置于30℃烘干箱內(nèi)烘干。接著對每孔加入200μL的0.01%結(jié)晶紫溶液，室溫下避光染色20 min。染色結(jié)束后倒掉孔中的結(jié)晶紫溶液并將96孔板輕輕浸沒于5 L裝滿水的燒杯中，不斷重復(fù)至燒杯中的水不再變色，置于30℃烘干箱內(nèi)烘干15 min。烘干孔內(nèi)干燥后，每孔添加200μL 95%乙醇，使結(jié)晶紫在室溫下溶解脫色15 min。每孔取出125μL洗脫液于新的透明96孔酶標(biāo)板中，利用全自動微生物生長曲線分析儀測量其在570 nm處的吸光值D（570）。每個樣品做3個平行。
1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析
實驗結(jié)果均以3組平行數(shù)據(jù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。文中使用SPSS 26.0軟件比較多組數(shù)據(jù)之間的差異（P<0.05認(rèn)為均值之間有顯著性差異），使用Origin 2021軟件制圖。
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