2.8噬菌體功能注釋
目前在VFDB中尚未檢索到噬菌體DK-13存在毒力基因；在CRAD數(shù)據(jù)庫(kù)中也尚未檢索到噬菌體DK-13存在耐藥基因。使用ORFs Finder和BLAST預(yù)測(cè)噬菌體DK-13的開(kāi)放閱讀框并注釋其功能，預(yù)測(cè)其共有293個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORF），其中已知功能的ORFs共有125個(gè)，可分為6個(gè)模塊：復(fù)制/重組模塊、包裝基因模塊、結(jié)構(gòu)基因模塊、核苷酸代謝基因模塊、轉(zhuǎn)錄/翻譯模塊和其他功能模塊，使用DNAMAN繪制噬菌體DK-13的基因組注釋圖譜（圖4）。具體包括：（1）復(fù)制/重組模塊：DNA聚合酶（ORF73）在催化合成DNA中有著重要作用，相關(guān)基因還有DNA連接酶（ORF47）、DNA解旋酶（ORF92、140、167）。（2）包裝基因模塊：末端酶小亞基（ORF3）和末端酶大亞基（ORF13）。在噬菌體復(fù)制過(guò)程中，需要對(duì)DNA進(jìn)行包裝這需要ATP引導(dǎo)的末端酶蛋白負(fù)責(zé)將DNA切成大小序列。T holin溶解介體（ORF101）是DK-13參與裂解宿主菌的相關(guān)基因，在裂解宿主菌的過(guò)程中起著重要作用。（3）結(jié)構(gòu)基因模塊：與結(jié)構(gòu)相關(guān)的蛋白編碼基因包括主要頭部蛋白（ORF22）、小外衣殼蛋白（ORF152）及短尾纖維蛋白（ORF7），它們?cè)谑删w吸附或感染起到重要作用。（4）核苷酸代謝基因模塊：包括還原酶小亞基（ORF76），核苷三磷酸焦磷酸水解酶（ORF155）等核苷酸代謝所需的相關(guān)酶類。（5）轉(zhuǎn)錄/翻譯模塊：與噬菌體的轉(zhuǎn)錄和翻譯有關(guān)的基因有轉(zhuǎn)錄修飾子（ORF135）和翻譯阻遏蛋白（ORF175）等7個(gè)噬菌體基因在噬菌體合成相關(guān)蛋白過(guò)程中發(fā)揮作用。（6）其他功能基因：這一模塊主要是一些目前對(duì)其在噬菌體內(nèi)的功能尚不可知的蛋白。
圖4噬菌體DK-13基因組注釋圖譜
箭頭方向代表基因方向。紅色：結(jié)構(gòu)基因模塊；棕色：包裝基因模塊；藍(lán)色：核苷酸代謝基因模塊；橙色：復(fù)制/重組基因模塊；粉色：轉(zhuǎn)錄/翻譯基因模塊；綠色：其他功能模塊；灰色：假定蛋白；黑色：GC含量
2.9噬菌體進(jìn)化分析
基于噬菌體DK-13的DNA連接酶序列，使用MEGA6軟件，對(duì)噬菌體DK-13做進(jìn)化關(guān)系分析。在GenBank中BLAST同源蛋白建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果如圖5所示，噬菌體DK-13與大腸埃希菌噬菌體vB_EcoM_VR20具有較近的親緣關(guān)系。
圖5噬菌體DK-13的進(jìn)化關(guān)系分析
2.10噬菌體DK-13在不同溫度下對(duì)污染豬肉殺菌效果的評(píng)價(jià)
實(shí)驗(yàn)在4℃和37℃的條件下使用噬菌體DK-13處理被EIEC污染的豬肉樣品。結(jié)果如圖6所示，在4℃條件下，對(duì)照組的EIEC數(shù)量在6 h內(nèi)幾乎沒(méi)有變化，實(shí)驗(yàn)組在噬菌體DK-13的作用下，EIEC數(shù)量第1小時(shí)后減少了約1.5個(gè)數(shù)量級(jí)，隨后保持穩(wěn)定；在37℃條件下，對(duì)照組的EIEC數(shù)量在6 h內(nèi)不斷增加，共增長(zhǎng)了約2個(gè)數(shù)量級(jí)，實(shí)驗(yàn)組在噬菌體DK-13的作用下，EIEC數(shù)量第1小時(shí)后減少了約1.5個(gè)數(shù)量級(jí)，6 h后增長(zhǎng)了0.5個(gè)數(shù)量級(jí)。從結(jié)果中可以看出，噬菌體DK-13在處理被EIEC污染的豬肉樣品時(shí)，4℃的殺菌效果好于37℃。
圖6不同溫度下噬菌體DK-13對(duì)污染豬肉的殺菌效果
A:4℃下噬菌體的殺菌效果；B：37℃下噬菌體的殺菌效果
3討論
食源性疾病是常見(jiàn)的全球公共衛(wèi)生問(wèn)題，引起腹瀉，腹痛等癥狀，主要因烹飪時(shí)生熟不分，食品保存不當(dāng)或廚師不注意衛(wèi)生所致。EIEC很容易通過(guò)污染的水源和食物進(jìn)行傳播。研究發(fā)現(xiàn)，耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌在動(dòng)物源、零售肉制品源及人源等3種樣本中傳播，且大腸埃希菌耐藥率最高。由于病原體對(duì)食品的污染，食品類行業(yè)每年都遭受巨大損失。噬菌體類生物制劑的出現(xiàn)對(duì)于食品安全的防治起到了重要作用。
噬菌體是地球上最豐富的生物體，約是全球細(xì)菌數(shù)量的10倍，噬菌體是所有新鮮食物中正常微生物中的一部分，已從各種食物中分離出來(lái)并且數(shù)量通常很多。由于常見(jiàn)的食品滅菌法，如巴氏殺菌法和食品高壓加工法等會(huì)影響食品的外觀及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，且因此噬菌體可被用作食品安全的生物防治劑，且噬菌體具有高度安全性，能夠特異性針對(duì)某些細(xì)菌的感染，并且保留一些食品原有特性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。Perera等的研究表明，使用ListShieldTM——一種專門針對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌的市售噬菌體混合物，處理污染的生菜和煙熏鮭魚(yú)等食物后細(xì)菌數(shù)量顯著降低的同時(shí)沒(méi)有改變食物的感官特性（包括味覺(jué)、視覺(jué)和嗅覺(jué)）。
本研究從污水中分離一株EIEC噬菌體DK-13，根據(jù)其透射電鏡形態(tài)及進(jìn)化分析表明是一株新的噬菌體，國(guó)際病毒分類委員會(huì)將其歸類為有尾噬菌體目（Caudovirales）肌尾噬菌體科（Myoviridae）T4噬菌體亞科（Tevenvirinae）噬菌體。噬菌體DK-13潛伏期很短（10 min）,暴發(fā)期較短（30 min），暴發(fā)量適中（164 PFU/cell）,表明DK-13在短時(shí)間內(nèi)就可以開(kāi)始繁殖，在較短時(shí)間內(nèi)就可完成裂解細(xì)菌的過(guò)程，因此在未來(lái)的應(yīng)用實(shí)踐中可較快地發(fā)揮作用；DK-13屬于窄譜噬菌體，與Yuan等的大腸桿菌噬菌體DY1同樣特異性較高。一方面專門針對(duì)宿主菌，對(duì)微生物群影響較小，然而另一方面卻限制了噬菌體的治療范圍。因此，未來(lái)使用“雞尾酒療法”噬菌體組合可以更廣泛地覆蓋不同種屬的細(xì)菌；DK-13酸堿耐受性和溫度穩(wěn)定性較強(qiáng)，具有較寬的工作范圍，對(duì)環(huán)境要求低。通過(guò)生物信息學(xué)對(duì)DK-13進(jìn)行全基因組及進(jìn)化樹(shù)分析，發(fā)現(xiàn)噬菌體DK-13與大腸埃希菌vB_EcoM_VR20進(jìn)化關(guān)系較為相近，同屬T4樣噬菌體，有功能的編碼區(qū)具有一定程度上的一致性，但沒(méi)有明顯的重排。噬菌體DK-13在4℃下6 h內(nèi)對(duì)于污染豬肉的EIEC的殺菌效果比37℃較好。噬菌體可能具有不同的生理特性，在低溫下比高溫更有效，同時(shí)也證明噬菌體能夠顯著降低肉制品中大腸埃希菌的污染。噬菌體DK-13基因組不存在毒力基因與耐藥基因，用于污染肉制品的防治是安全有效的，未來(lái)作為生物防治劑,具有應(yīng)用前景。
當(dāng)前在食品衛(wèi)生防治領(lǐng)域，針對(duì)幾種主要的食源性致病菌，目前已生產(chǎn)出了相對(duì)應(yīng)的噬菌體制劑：一種針對(duì)李斯特的商用單噬菌體制劑可以有效降低切片火腿中李斯特菌的水平，且效果優(yōu)于乳酸鏈球菌素和乳酸鈉；另一種針對(duì)志賀氏菌的噬菌體雞尾酒制劑ShigaShieldTM可以將生菜、雞胸肉和鮭魚(yú)等食物中志賀氏菌的水平顯著降低。然而，仍需確定噬菌體對(duì)人體的作用及影響，對(duì)其生物學(xué)特性，免疫特性及基因分析進(jìn)行更深層次的探究。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，在未來(lái)噬菌體將很快被用于食品安全的防治。
4結(jié)論
從醫(yī)院污水中新分離的EIEC噬菌體DK-13，裂解性強(qiáng)，特異性強(qiáng)，對(duì)溫度及酸堿穩(wěn)定性良好，在污染的豬肉樣品中具有較好的殺菌效果。
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