1.4 RT-qPCR
使用Trizol法提取總RNA，取病毒液和TriQuick Reagent混勻后靜置，加入三氯甲烷分離有機(jī)相和無機(jī)相，離心后取上清，加入等量異丙醇萃取RNA，使用經(jīng)DEPC水處理的75%酒精洗去殘留的異丙醇，加入9.5μL無RNA酶水重懸管底核酸，按試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后，使用SYBE Green染料法檢測。其中，RT-qPCR反應(yīng)體系如下:1μL cDNA，10μL 2×AugeGreen qPCR Master Mix，上、下游引物各0.5μL，8μL無菌純化水。擴(kuò)增條件為酶激活95℃120 s;然后采用三步法，即95℃5 s，56℃5 s，72℃25 s，共進(jìn)行45次循環(huán)，每個樣品重復(fù)3次。
1.5免疫印跡(Western blot)
待Vero細(xì)胞長滿單層后首先用PEDV感染或SLM處理細(xì)胞，然后用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞，再用含有蛋白酶抑制劑混合物的細(xì)胞裂解緩沖液裂解，4℃離心后收集上清液，加入上樣緩沖液，混勻后105℃變性10 min，然后用SDS-PAGE分離蛋白樣品，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，再用含有5%脫脂奶粉的TBST溶液在室溫將PVDF膜封閉2 h，然后加入PEDV N蛋白單克隆抗體(1∶500)、小鼠抗GAPDH單克隆抗體(1∶10 000)4℃孵育過夜，再用TBST洗滌PVDF膜，然后加入HRP-山羊抗小鼠IgG(1∶10 000)室溫孵育1.5 h，再次洗膜后用ECL發(fā)光液檢測目的蛋白。
1.6間接免疫熒光試驗(yàn)(indirect immunofluorescent assay，IFA)
將Vero細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待單層細(xì)胞長到90%后用PBS洗滌細(xì)胞并分組，首先用冰冷的甲醇于-20℃固定細(xì)胞10 min，然后用PBS洗滌，使用2%BSA-PBS溶液37℃封閉1 h，然后棄上清，加入PEDV N蛋白單克隆抗體(1∶200)37℃孵育1 h，再用PBS洗滌后加入FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(1∶500)37℃孵育45 min，再次用PBS洗滌后加入DAPI染色溶液(Bisben Iimde)室溫避光顯色，洗滌后拍干，最后用熒光顯微鏡觀察結(jié)果并拍照，使用Image J統(tǒng)計陽性細(xì)胞率。陽性細(xì)胞率(%)=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100。
1.7半數(shù)細(xì)胞毒性濃度(CC50)的測定
待96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中長滿單層Vero細(xì)胞后用PBS洗滌，并分組，然后用不同濃度SLM處理細(xì)胞，并設(shè)置只含營養(yǎng)液而沒有細(xì)胞的孔作為空白對照，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。根據(jù)增強(qiáng)型CCK-8細(xì)胞活性試劑盒說明書，每孔加入10μL工作液后再置于37℃孵育1 h，最后使用酶標(biāo)儀讀取OD450 nm值。
細(xì)胞活力(%)=(OD450 nm天然產(chǎn)物孔-OD450 nm空白對照)/(OD450 nm陰性對照-OD450 nm空白對照)×100。將細(xì)胞活力與藥物濃度的數(shù)據(jù)導(dǎo)入到GraphPad Prism 5.0中，使用Analyze下的transform功能，轉(zhuǎn)換成細(xì)胞活力與lg(藥物濃度)的關(guān)系，進(jìn)一步使用Analyze下的XY analyses的Nonlinear regression非線性擬合功能，利用log(inhibitor)vs.response-Variable slope(four parameters)選項(xiàng)，得到擬合曲線和CC50值。
1.8半數(shù)抑制濃度(IC50)的測定
待96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中長滿單層的Vero細(xì)胞后用PBS洗滌細(xì)胞，然后用不同濃度SLM處理細(xì)胞，每個濃度重復(fù)8個孔，每孔加入100μL含有相應(yīng)SLM濃度的維持液預(yù)處理細(xì)胞1 h，棄掉孔內(nèi)液體，再用含有0.2 MOI PEDV和相應(yīng)SLM濃度的混合液處理細(xì)胞1 h，并設(shè)置僅含有維持液的陰性對照孔和僅接毒不加藥的陽性對照孔，最后將孔內(nèi)液體更換為含有相應(yīng)SLM濃度的維持液繼續(xù)培養(yǎng)72 h，肉眼觀察CPE并統(tǒng)計。
抑制率(%)=(1-FL天然產(chǎn)物孔/FL陰性對照)×100。將抑制率與藥物濃度的數(shù)據(jù)導(dǎo)入到GraphPad Prism 5.0中，使用Analyze下的transform功能，轉(zhuǎn)換成抑制率與lg(藥物濃度)的關(guān)系，進(jìn)一步使用Analyze下的XY analyses的Nonlinear regression非線性擬合功能，利用lg(inhibitor)vs.response-Variable slope(four parameters)選項(xiàng)得到擬合曲線和IC50值。
1.9 SLM對PEDV增殖的抑制作用
將Vero細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待長滿單層細(xì)胞后，棄上清，用PBS洗滌細(xì)胞加入含有不同SLM濃度(0.05、0.5、5μmol·L-1)的維持液，在37℃培養(yǎng)箱預(yù)處理細(xì)胞1 h，隨后用PBS洗滌細(xì)胞，再用0.2 MOI PEDV感染細(xì)胞1 h，然后將病毒液更換為含有相應(yīng)SLM濃度的維持液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞上清液測定TCID50，提取核酸和蛋白用于測定病毒N基因水平和N蛋白含量，IFA觀察病毒分布并計算陽性細(xì)胞率。
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