4.甲基化分析
為了確定糖苷殘基的連接模式，對多糖進(jìn)行了甲基化分析。原始多糖（L01-B1）、降解多糖（L01-B102-I）和還原多糖的甲基化分析結(jié)果見表2和圖S5，L01-B1和RL01-B1中PMAAs的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC?MS）譜圖見圖S6。根據(jù)甲基化數(shù)據(jù)和單糖組成分析結(jié)果的結(jié)合，L01-B1的主要連接模式如下：1,4-GalpA（11.1%）、1,2-Rhap（5.57%）、1,2,4-Rhap（9.56%）、T-Galp（9.37%）、1,4-Galp（14%）、1,3,6-Galp（6.67%）、1,6-Galp（4.24%）、1,3-Galp（3.22%）、T-Araf（8.83%）、1,5-Araf（21.07%）、1,3,5-Araf（4.97%）和T-GlcpA（1.4%）。與原始多糖的甲基化數(shù)據(jù)相比，L01-B1中未檢測到T-Glcp，而在還原多糖RL01-B1中檢測到1.4%的T-Glcp。這一發(fā)現(xiàn)表明，原始多糖中的葡萄糖醛酸殘基以T-GlcpA的形式存在。此外，比較原始多糖和還原產(chǎn)物的甲基化數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)還原產(chǎn)物中1,4-Galp的含量顯著增加，表明原始多糖中的半乳糖醛酸殘基以1,4-GalpA的形式存在。
與L01-B1相比，L01-B102-I中鼠李糖和半乳糖醛酸的比例增加，同時1,6-Galp的含量增加，而1,4-Galp、1,3,6-Galp和1,3-Galp的含量減少。這些數(shù)據(jù)表明，主鏈包含1,6-Galp，并且在C-3位有一些1,6-Galp分支。通過核磁共振（NMR）進(jìn)一步分析了具體的分支結(jié)構(gòu)。觀察到1,2-Rhap的增加和1,2,4-Rhap的減少表明分支連接在1,2-Rhap的C-4位。部分酸水解切斷了這些分支，導(dǎo)致1,2-Rhap含量的增加。
這些發(fā)現(xiàn)表明，該多糖的主鏈由1,4-GalpA、1,2-Rhap（或1,2,4-Rhap）和1,6-Galp組成。
5.核磁共振（NMR）分析
通過整合單糖組成、甲基化分析和部分酸水解的結(jié)果，對L01-B1及其降解產(chǎn)物L(fēng)01-B102-I的一維NMR譜圖（圖2）和二維NMR譜圖（圖3）進(jìn)行了分析，并完成了信號歸屬。
在L01-B1的1H NMR譜圖（圖2a）中，異頭質(zhì)子區(qū)域的信號分別為：5.30 ppm（T-α-Araf(A)的H-1）、5.22 ppm（1,3,5-α-Araf(C)的H-1）、5.16 ppm（1,5-α-Araf(B)的H-1）、4.70 ppm（T-β-Galp(D)的H-1）、4.55 ppm（1,3,6-β-Galp(F)的H-1）和4.71 ppm（1,4-β-Galp(H)的H-1）。1,3-β-Galp(E)和1,6-β-Galp(G)的H-1信號峰在4.59 ppm處重疊。此外，1,2-α-Rhap(J)和1,2,4-α-Rhap(K)的H-1信號峰在5.30 ppm處重疊。5.08 ppm和4.69 ppm處的信號分別歸屬于1,4-α-GalpA(I)和T-β-GlcpA(L)的H-1。1.32 ppm和1.37 ppm處的信號分別歸屬于1,2-α-Rhap(J)和1,2,4-α-Rhap(K)的甲基碳的H信號。
在L01-B102-I的1H NMR譜圖（圖2b）中，異頭質(zhì)子區(qū)域的信號分別為：4.68 ppm（1,3-β-Galp(e)的H-1）、4.54 ppm（1,3,6-β-Galp(f)的H-1）和4.69 ppm（1,4-β-Galp(h)的H-1）。T-β-Galp(d)和1,6-β-Galp(g)的H-1信號峰在4.51 ppm處重疊，而1,2-α-Rhap(j)和1,2,4-α-Rhap(k)的H-1信號峰在5.28 ppm處重疊。5.10 ppm和4.66 ppm處的信號分別歸屬于1,4-α-GalpA(i)和T-β-GlcpA(l)的H-1。
在L01-B1的13C NMR譜圖（圖2c,圖S7a）中，異頭碳區(qū)域的信號分別為：110.54 ppm（T-α-Araf(A)的C-1）、108.75 ppm（1,5-α-Araf(B)的C-1）、108.34 ppm（1,3,5-α-Araf(C)的C-1）、104.62 ppm（T-β-Galp(D)的C-1）、103.99 ppm（1,3-β-Galp(E)的C-1）和105.59 ppm（1,4-β-Galp(H)的C-1）。1,3,6-β-Galp(F)和1,6-β-Galp(G)的C-1信號峰在104.84 ppm處重疊。1,2-α-Rhap(J)和1,2,4-α-Rhap(K)的C-1信號峰在99.96 ppm處重疊。1,4-α-GalpA(I)的C-1信號為98.84 ppm。T-β-GlcpA(L)的C-1信號較弱，為102.65 ppm。1,4-α-GalpA(I)和T-β-GlcpA(L)的羧基碳信號分別為175.29 ppm和174.62 ppm。1,2-α-Rhap(J)和1,2,4-α-Rhap(K)的甲基碳信號分別為17.84 ppm和18.09 ppm。
在L01-B102-I的13C NMR譜圖（圖2d,圖S7b）中，異頭碳區(qū)域的信號分別為：104.94 ppm（T-β-Galp(d)的C-1）、104.20 ppm（1,3-β-Galp(e)的C-1）和105.60 ppm（1,4-β-Galp(h)的C-1）。1,3,6-β-Galp(f)和1,6-β-Galp(g)的C-1信號峰在104.68 ppm處重疊。1,2-α-Rhap(j)和1,2,4-α-Rhap(k)的C-1信號峰在100.32 ppm處重疊。1,4-α-GalpA(i)的C-1信號為98.99 ppm。T-β-GlcpA(l)的C-1信號較弱，為102.66 ppm。
在L01-B1的DEPT 135°譜圖（圖S7c）中，68.10 ppm、68.09 ppm和62.30 ppm處的倒置峰分別歸屬于1,3,5-α-Araf(C)、1,5-α-Araf(B)和T-α-Araf(A)的C-5。62.14 ppm、61.79 ppm和61.95 ppm處的倒置峰分別歸屬于T-β-Galp(D)、1,3-β-Galp(E)和1,4-β-Galp(H)的C-6。1,6-β-Galp(G)和1,3,6-β-Galp(F)的C-6信號峰在70.53 ppm處重疊。其他信號歸屬基于HSQC譜圖（圖3a）和COSY譜圖（圖S8a）詳細(xì)列出在表3中。在L01-B102-I的DEPT 135°譜圖（圖S7d）中，62.24 ppm、61.96 ppm和62.24 ppm處的倒置峰分別歸屬于T-β-Galp(d)、1,3-β-Galp(e)和1,4-β-Galp(h)的C-6。1,6-β-Galp(g)和1,3,6-β-Galp(f)的C-6信號峰在70.74 ppm處重疊。其他信號歸屬基于HSQC譜圖（圖3b）和COSY譜圖（圖S8b）詳細(xì)列出在表4中。
圖2.（a）L01-B1的1H NMR譜圖。（b）L01-B102-I的1H NMR譜圖。（c）L01-B1的13C NMR譜圖。（d）L01-B102-I的13C NMR譜圖。（a）和（b）展示了L01-B1中各種糖苷鍵對應(yīng)的異頭質(zhì)子的化學(xué)位移，而（c）和（d）則顯示了異頭碳和與1,6-β-Galp殘基相關(guān)的C-6特征共振信號。
圖3.（a）L01-B1的二維NMR譜圖。（b）L01-B102-I的二維NMR譜圖。疊加了HSQC（紅色）和HMBC（黑色）譜圖。（A:T-α-Araf;B:1,5-α-Araf;C:1,3,5-α-Araf;D/d:T-β-Galp;E/e:1,3-β-Galp;F/f:1,3,6-β-Galp;G/g:1,6-β-Galp;H/h:1,4-β-Galp;I/i:1,4-α-GalpA;J/j:1,2-α-Rhap;K/k:1,2,4-α-Rhap;L/l:T-β-GlcpA）
通過L01-B1的HMBC譜圖（圖3a），可以確定糖苷鍵之間的順序連接性。δ105.59/4.23和δ81.41/4.71處的交叉峰表明，1,4-β-Galp(H)的C-1與1,4-β-Galp(H)的H-4相關(guān)聯(lián)，且1,4-β-Galp(H)的C-4與1,4-β-Galp(H)的H-1相關(guān)聯(lián)，表明存在連續(xù)的1,4-β-Galp結(jié)構(gòu)。
δ105.59/3.78處的交叉峰表明，1,4-β-Galp殘基連接到1,2,4-α-Rhap的C-4。此外，δ103.99/3.71處的交叉峰表明，1,3-β-Galp(E)的C-1與1,3,6-β-Galp(F)的H-3相關(guān)聯(lián)，表明1,3-Galp殘基連接到1,3,6-β-Galp的C-3。δ81.46/4.70處的交叉峰表明，T-β-Galp殘基連接到1,3,6-β-Galp的C-3。δ83.65/5.30處的交叉峰表明，1,3-β-Galp(E)的C-3與T-α-Araf(A)的H-1相關(guān)聯(lián)，表明T-α-Araf殘基連接到1,3-β-Galp。δ108.75/3.84和δ68.09/5.16處的交叉峰表明，1,5-α-Araf(B)的C-1與1,5-α-Araf(B)的H-5相關(guān)聯(lián)，且1,5-α-Araf(B)的C-5與1,5-α-Araf(B)的H-1相關(guān)聯(lián)，表明存在連續(xù)的1,5-α-Araf殘基鏈。δ68.10/5.30處的交叉峰表明，1,3,5-α-Araf(C)的C-5與T-α-Araf(A)的H-1相關(guān)聯(lián)，表明T-α-Araf殘基連接到1,3,5-α-Araf。δ85.17/5.30處的交叉峰表明，1,3,5-α-Araf(C)的C-3與T-α-Araf(A)的H-1相關(guān)聯(lián)。δ108.75/4.02處的交叉峰表明，1,5-α-Araf殘基連接到1,3,5-α-Araf的C-3。δ77.56/5.16處的交叉峰表明，1,5-α-Araf(B)的H-1與1,2,4-α-Rhap(K)的C-4相關(guān)聯(lián)，表明1,5-α-Araf殘基連接到1,2,4-α-Rhap的C-4。此外，δ108.75/3.85處的交叉峰表明，1,5-α-Araf(B)的C-1與1,3,5-α-Araf(C)的H-5相關(guān)聯(lián)，表明1,5-α-Araf殘基連接到1,3,5-α-Araf的C-5。最后，δ77.56/4.69處的交叉峰表明，T-β-GlcpA(L)的H-1與1,2,4-Rhap(K)的C-4相關(guān)聯(lián)。
在L01-B102-I的HMBC譜圖（圖3b）中，δ98.99/4.20處的交叉峰表明，1,4-α-GalpA(i)的C-1與1,2,4-α-Rhap(k)的H-2相關(guān)聯(lián)，δ77.80/5.10處的交叉峰表明，1,2,4-α-Rhap(k)的C-2與1,4-α-GalpA(i)的H-1相關(guān)聯(lián)，δ100.32/4.52處的交叉峰表明，1,2,4-α-Rhap(k)（或1,2-α-Rhap(j)）的C-1與1,4-α-GalpA(i)的H-4相關(guān)聯(lián)，δ78.53/5.28處的交叉峰表明，1,4-α-GalpA(i)的C-4與1,2,4-α-Rhap(k)（或1,2-α-Rhap(j)）的H-1相關(guān)聯(lián)。
綜合這些糖苷相關(guān)性，表明1,2-α-Rhap和1,4-α-GalpA可能交替構(gòu)成L01-B1的主鏈，并且側(cè)鏈連接到1,2,4-α-Rhap殘基的C-4。此外，δ70.74/5.28處的交叉峰表明，1,3,6-β-Galp(f)的C-6與1,2,4-α-Rhap(k)（或1,2-α-Rhap(j)）的H-1相關(guān)聯(lián)，表明在主鏈的果膠結(jié)構(gòu)域上，1,2,4-α-Rhap（或1,2-α-Rhap）連接到1,6-β-Galp的C-6。δ104.68/4.10和δ70.74/4.54處的交叉峰表明，1,6-β-Galp(g)（或1,3,6-β-Galp(f)）的C-1與1,6-β-Galp(g)的H-6相關(guān)聯(lián)，且1,6-β-Galp(g)的C-6與1,3,6-β-Galp(f)的H-1相關(guān)聯(lián)，表明主鏈上存在連續(xù)的1,6-β-Galp殘基，并且在1,3,6-Galp的C-3處有分支。
為了進(jìn)一步闡明側(cè)鏈結(jié)構(gòu)，對L01-B102-O進(jìn)行了ESI?MS分析，結(jié)果見圖S9。綜合上述數(shù)據(jù)，以及單糖組成分析結(jié)果、甲基化分析結(jié)果和多糖的分子量，得出了L01-B1的可能結(jié)構(gòu)，見圖4。
圖4.L01-B1的可能結(jié)構(gòu)。Galp:半乳糖；GalpA:半乳糖醛酸；Rhap:鼠李糖；Araf:阿拉伯糖；GlcpA:葡萄糖醛酸。
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