1.2.316SrRNA基因序列克隆與分析。
以1∶100的比例，將“1.2.2”中分離純化的菌液接種于400μLLB液體培養(yǎng)基，于37℃振蕩培養(yǎng)6h，通過細(xì)菌全基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌DNA后對(duì)其16SrRNA進(jìn)行基因克隆、測(cè)序與分析，對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定，引物分別為：27F（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）和1492R（GGTTACCTTGTTACGACTT）。PCR體系為20μL：1μL模板、1μL上游引物、1μL下游引物、7μLddH2O、10μL2×SanTaqPCRMix預(yù)混液，35個(gè)循環(huán)。通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物并于紫外光下確認(rèn)產(chǎn)物大小符合預(yù)期，寄送至生工生物工程（廣州）股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。
1.2.4生化鑒定。
無菌條件下，取100μLS1菌液在TSA平板上劃線涂板，于28"℃下培養(yǎng)12h，取單菌落接種在微量生化反應(yīng)管中，將微量生化反應(yīng)管放置28℃培養(yǎng)18～24h，根據(jù)杭州濱和微生物試劑有限公司《細(xì)菌微量生化反應(yīng)管說明書》確認(rèn)S1細(xì)菌生化反應(yīng)結(jié)果。通過《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》《常見細(xì)菌鑒定手冊(cè)》對(duì)S1生化特性進(jìn)行鑒定。
1.2.5藥敏試驗(yàn)。
在無菌條件下制備10個(gè)TSA平板，每個(gè)平板均勻涂布100μL菌液，等距平貼3張藥敏紙片。以3個(gè)不同角度測(cè)量每個(gè)抑菌環(huán)直徑，最后取3次測(cè)量的平均值，長度單位mm，記錄在冊(cè)，整理并以《NCCLS藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)》和杭州濱和微生物試劑有限公司《抗生素類藥敏紙片使用說明書》為標(biāo)準(zhǔn)判斷藥敏試驗(yàn)結(jié)果。
1.2.6細(xì)菌生長曲線繪制。
在無菌條件下接種哈維氏弧菌至裝有5 mL TSB培養(yǎng)基的試管中，于28℃培養(yǎng)12 h；再以1∶100比例接種菌液于裝有100 mL TSB培養(yǎng)基的錐形瓶，于28℃培養(yǎng)；選擇不同時(shí)間點(diǎn)（0、0.5、1.5、2.5、3.0、5.0、6.5、8.0、12.0、16.0、20.0和24.0 h），收集菌液，在無菌條件不同稀釋倍數(shù)下（×105、×107、×109和×1011倍）涂布在TSA平板上，于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后計(jì)數(shù)，有效計(jì)數(shù)范圍為10～200。同時(shí)通過分光光度計(jì)在波長600 nm條件下測(cè)量該時(shí)間點(diǎn)的OD 600值，菌液濃度較高時(shí)，將菌液稀釋至OD600值在0.4～0.6區(qū)間再進(jìn)行測(cè)量，測(cè)量結(jié)果乘稀釋倍數(shù)，記錄在冊(cè)。
2結(jié)果與分析
2.1魚病診斷結(jié)果
對(duì)Ec1、Ec2、Ec33條患病斜帶石斑魚進(jìn)行目檢，發(fā)現(xiàn)其均體表變黑，嚴(yán)重潰爛并出現(xiàn)不規(guī)則的白色隆起疥瘡。Ec1背鰭相對(duì)完好，尾鰭開始潰爛，胸部和尾部有充血。Ec2頭部和胸部有白色疥瘡，尾鰭有潰爛，嘴部充血。Ec3體表出現(xiàn)大量不規(guī)則白色疥瘡，還出現(xiàn)了淡黃色結(jié)節(jié)，尾鰭和背鰭完全潰爛。
對(duì)Ec1、Ec2、Ec33條患病斜帶石斑魚進(jìn)行剖檢，發(fā)現(xiàn)其體內(nèi)肝臟充血（圖1～3）。Ec1肝臟充血腫大，脾臟糜爛消解不見，腸道內(nèi)部呈黃色，有積水和脹氣。Ec2鰓部糜爛呈灰色，肝臟充血，脾臟充血呈熔解態(tài)，腸道內(nèi)部呈黃色。Ec3鰓部糜爛，肝臟充血，脾臟充血，腸道發(fā)紅，有脹氣。
根據(jù)目檢結(jié)果和剖檢結(jié)果，初步判斷，患病斜帶石斑魚是受到細(xì)菌感染所致。
2.2細(xì)菌分離純化
對(duì)Ec1、Ec2、Ec3體表病灶（Sk）、肝臟（Li）、脾臟（Sp）3個(gè)出現(xiàn)病理變化的部位在TSA平板、LB平板、TCSB平板劃線接種。其中，LB平板上菌落數(shù)量相較TSA平板和TCBS平板上菌落數(shù)量明顯減少，證明分離出的細(xì)菌更需要高營養(yǎng)培養(yǎng)基。TSA培養(yǎng)基對(duì)細(xì)菌沒有篩選作用，且營養(yǎng)豐富，菌落生長數(shù)量最高，但形態(tài)并無較大差異。劃線培養(yǎng)后TCBS瓊脂培養(yǎng)基對(duì)細(xì)菌具有篩選作用，Ec1、Ec2、Ec3體表病灶（Sk）、肝臟（Li）、脾臟（Sp）3個(gè)出現(xiàn)病理變化的部位劃線接種于TCBS平板上培養(yǎng)后均出現(xiàn)黃色且大小、形態(tài)一致的菌落。
挑選其中優(yōu)勢(shì)菌落，單菌落接種于400μLLB液體培養(yǎng)基（表1），37℃振蕩培養(yǎng)12h后在菌液中添加等體積濃度為40%的滅菌甘油，于-80℃保存。
2.316SrRNA序列分析
將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接通過Blast進(jìn)行分析，并通過MEGA7.0進(jìn)行多序列比對(duì)和同源建樹，以Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。分析顯示，S116SrRNA基因序列為1191bp，Blast結(jié)果顯示該菌株同哈維氏弧菌其他菌株差異較大，與2018年被報(bào)道的V.harveyihq-V149聚為一支（圖4）。
2.4細(xì)菌生化特性
哈維氏弧菌S1的生理生化反應(yīng)結(jié)果顯示（表2），阿拉伯糖、鳥氨酸脫羧酶葡萄糖、賴氨酸脫羧酶、精氨酸脫羧酶、甘露醇、蕈糖等反應(yīng)為陽性，蛋白胨水、精氨酸雙水解酶、核糖、肌醇、硫化氫等反應(yīng)為陰性。同《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》《常見細(xì)菌鑒定手冊(cè)》上哈維氏弧菌的生化特征吻合。
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