3討論
當前，應用于水稻白葉枯病防治的化學藥劑存在種類少、對環(huán)境影響大且因長期使用而導致功效不足等問題，因此尋找安全高效的新型抗菌劑以防治水稻細菌病害是當前的迫切需求。噬菌體是一種能夠特異性裂解細菌的病毒，能夠有效防治多種病原菌，且不會對其他有益微生物群落造成影響，被視為理想抗菌劑之一。如今隨著研究的深入，噬菌體在醫(yī)療、農業(yè)、食品等領域的細菌防治中扮演了越來越重要的角色。
本文從稻蝦田水中分離得到一株能夠裂解水稻黃單胞菌的噬菌體vB_XaS_HDB2。用于生物防治的噬菌體必須遺傳背景清晰，且不攜帶耐藥和毒力基因，否則可能造成耐藥和毒力基因在細菌間水平轉移。裂解模塊直接參與細菌裂解，HDB2裂解模塊中具有3個ORF 21、22、23，分別被注釋為穿孔素(holin)、裂解酶(lysin)和膜融合蛋白(spanin)。噬菌體介導的革蘭氏陽性菌裂解通常由穿孔素—裂解酶系統(tǒng)參與;裂解酶是噬菌體在復制后期表達的一類水解酶，作用于細胞壁肽聚糖，導致細胞壁破裂從而釋放子代噬菌體;穿孔素是一種跨膜蛋白，能夠在細胞膜中形成非特異性的跨膜通道，以便釋放細胞內的裂解酶。膜融合蛋白是裂解革蘭氏陰性菌所需的第3種蛋白。革蘭氏陰性菌因其外膜保護肽聚糖層，對噬菌體裂解酶具有天然的抗性，因此還需要膜融合蛋白介導產生橫跨內、外膜的通道，幫助子代噬菌體釋放。裂解酶因其能特異性消滅細菌且不易產生抗性、裂解譜較寬廣等特點同樣引起了研究人員的注意，成為了當前的研究熱點。將來我們可以進一步嘗試對噬菌體HDB2的裂解酶進行過表達，探究其殺菌能力。
HDB2不含毒力基因和抗生素耐藥基因，表明該噬菌體在基因水平上具有較好的安全性，可以用于細菌的防治。同時，HDB2含有一個tRNA基因，對于噬菌體編碼的tRNA的作用，暫時還未有明確的解釋，目前最廣泛接受的假設是密碼子補償，即宿主很少使用但噬菌體必需的密碼子是由噬菌體編碼的tRNA補充的。而近年來Yang等提出的“噬菌體tRNA代表了一種抵消宿主tRNA耗竭的手段”說法也獲得了部分人支持，該觀點認為通過下調噬菌體tRNA的表達，修改tRNA使其無法用于翻譯等使噬菌體tRNA可以作為一種機制來抵消噬菌體感染期間反密碼子核酸酶對tRNA的消耗，從而使噬菌體能夠翻譯其蛋白質并成功完成感染周期。有研究分析了烈性噬菌體與溶源噬菌體之間的差異，發(fā)現(xiàn)烈性噬菌體含有更多的tRNA，推測tRNA可能有助于噬菌體獲取更高的裂解性。此外還有關于噬菌體tRNA有助于在感染期間維持生長或擴大噬菌體的宿主范圍等假設。在本團隊的烈性噬菌體資源庫中，噬菌體vB_BceS_LY1、vB_VpaP_DE10、vB_VpP_DE17、vB_VpaP_FE11、vB_VpP_ AC2均未預測到tRNA基因，vB_VpP_BA6被預測含有3個tRNA基因、vB_VpS_CA8和vB_ VpS_BA3含有1個tRNA，關于噬菌體tRNA的功能作用，還有待進一步研究。
本試驗將噬菌體與宿主菌共培養(yǎng)，初步探究了噬菌體HDB2在體外試驗中對宿主菌的抑菌效果，為噬菌體應用提供了參考。結果顯示，添加的噬菌體數(shù)量越多即MOI越高，抑菌效果越明顯。值得注意的是將噬菌體與宿主菌共培養(yǎng)的48 h內，出現(xiàn)了細菌濃度先降低后升高的現(xiàn)象，推測這是因為剛開始噬菌體大量裂解細菌導致菌液濃度降低，但后續(xù)由于噬菌體抗性菌的出現(xiàn)，細菌再度增長。噬菌體和它們的宿主細菌會不斷的共同進化，在此過程中，細菌主要以3種方式逃避噬菌體感染。第1種是受體適應，噬菌體感染成功的關鍵是噬菌體與細菌表面受體特異性結合，細菌通過隨機突變或者水平基因轉移，使得受體變異，噬菌體無法吸附，從而抵擋住噬菌體感染。第2種是宿主防御系統(tǒng)保護，細菌在被噬菌體侵染過程中進化出各種免疫系統(tǒng)來抵御噬菌體感染。目前已知最廣泛的防御系統(tǒng)是細菌限制修飾(restriction modification，RM)系統(tǒng)，RM系統(tǒng)作為免疫系統(tǒng)攻擊進入細胞的噬菌體DNA，從而使這些DNA被限制性內切酶水解，而細菌自身的DNA在甲基化酶的作用下被保護起來，使得細菌不會受到傷害。此外還有CRISPR-Cas系統(tǒng)、流產感染(abortive infection，Abi)系統(tǒng)等。第3類是噬菌體衍生防御系統(tǒng)。如Sie系統(tǒng)，這是噬菌體進入宿主后為細菌提供的防御系統(tǒng)，目的在于防止細菌被相同或密切相關的噬菌體再次感染。噬菌體抗性菌的產生使其抑制細菌的效果大大被削弱，這是噬菌體防治細菌感染需要解決的主要問題之一。針對這一問題，研究學者們提出了噬菌體雞尾酒療法，噬菌體—抗生素聯(lián)合應用，使用基因工程改造噬菌體以及利用噬菌體裂解酶療法等新的策略來應對。使用不同組合的噬菌體雞尾酒除能夠擴大宿主譜、增強殺菌性能外，還可以有效抑制或延緩噬菌體耐藥性的出現(xiàn)。Yoo等利用噬菌體抗性細菌分離得到的4株噬菌體構建了3種噬菌體雞尾酒，它們對多重耐藥肺炎克雷伯菌表現(xiàn)出較強的抑制能力。值得注意的是，有些已經對噬菌體產生抗性的細菌菌株，在加入噬菌體雞尾酒后，對雞尾酒中其他噬菌體產生抗性后，可以對原來的噬菌體重新敏感。此外，研究人員認為，噬菌體耐藥性的出現(xiàn)可能會影響細菌對抗生素的敏感性，使得細菌對抗生素重新敏感。他們推測是因為噬菌體在侵染細菌過程中可能依賴于細胞膜蛋白或其他表面結構，而在某些情況下，這些結構也與細菌的抗生素耐藥性密切相關。因此，先單獨使用噬菌體進行治療，在產生噬菌體抗性后再轉向使用抗生素也是對抗噬菌體抗性的對策之一。
4結論
本文分離得到的黃單胞菌噬菌體vB_XaS_HDB2耐受性強，對紫外線較敏感，不含毒力基因和耐藥基因，安全性較高。MOI大于0.1時，HDB2對黃單胞菌有較好的抑制效果，具有作為新型抗菌劑防治水稻白葉枯病的潛力，可為噬菌體進一步研究與應用提供理論依據(jù)。