2 結(jié)果與分析
2.1 gIgE同源臂片段的鑒定
以FHV-1 H07作為模板,通過PCR獲得包含整個(gè)gIgE左同源臂、gIgE基因以及gIgE右同源臂片段。PCR結(jié)果(圖1)中出現(xiàn)1條3 789 bp的目的條帶,回收后進(jìn)行基因序列測(cè)定,將測(cè)序結(jié)果與C-27株的序列進(jìn)行比對(duì),表明成功獲取同源臂片段。
圖1 gIgE同源臂片段的PCR結(jié)果
2.2 敲除質(zhì)粒sgRNA的構(gòu)建與驗(yàn)證
酶切pX458-Neo R質(zhì)粒獲得的線性載體片段的電泳結(jié)果(圖2-A)顯示了1條9 400 bp的目的條帶,回收此條帶并分別與3 條sgRNA片段室溫過夜連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)Stbl3大腸桿菌。次日每種sgRNA各挑取單個(gè)菌落,培養(yǎng)3～4 h后吸取100 μL菌液進(jìn)行測(cè)序,將與圖譜序列一致的菌種(圖2-B)質(zhì)粒進(jìn)行提取,即是敲除質(zhì)粒sgRNA。
圖2 sgRNA質(zhì)粒的構(gòu)建與驗(yàn)證結(jié)果
2.3 gIgE基因缺失病毒的免疫熒光鑒定
將合成的轉(zhuǎn)移載體pUC-gIgE-L-RFP-R和3條sgRNA分別轉(zhuǎn)染F81細(xì)胞,再用FHV-1 H07感染F81細(xì)胞。48 h后在熒光顯微鏡下觀察到有零星紅色熒光產(chǎn)生(圖3-A),表明紅色熒光蛋白R(shí)FP得到成功表達(dá)。用重組病毒、野病毒混合液進(jìn)行噬斑純化,待顯微鏡下觀察有RFP表達(dá)的細(xì)胞病變占總細(xì)胞病變的80%～90%時(shí)進(jìn)行有限稀釋及進(jìn)一步純化,篩選到有細(xì)胞病變處且都有RFP表達(dá)的單個(gè)孔(圖3-B、C),命名此病毒為FHV-ΔgIgE-RFP。
圖3 熒光顯微鏡下gIgE基因缺失重組病毒構(gòu)建及鑒定
2.4 重組病毒PCR的鑒定結(jié)果
提取FHV-ΔgIgE-RFP以及H07基因組DNA,用驗(yàn)證gIgE引物cx-gIgE-F/R進(jìn)行PCR,電泳結(jié)果顯示,FHV-ΔgIgE-RFP無任何條帶,說明重組病毒已純化成功,而H07作為陽性對(duì)照出現(xiàn)了1條419 bp的目的條帶(圖4-A)。用驗(yàn)證RFP引物cx-RFP-F/R進(jìn)行PCR,電泳結(jié)果顯示,FHV-ΔgIgE-RFP出現(xiàn)1條314 bp的目的條帶,說明紅色熒光蛋白基因RFP已成功插入FHV-1基因組中并成功表達(dá)(圖4-B)。將有目的條帶的PCR產(chǎn)物測(cè)序,結(jié)果顯示與預(yù)期序列一致。
圖4 重組病毒的PCR鑒定
2.5 重組病毒與親本病毒的TCID50
使用Reed-Muench方法計(jì)算重組病毒與親本病毒的病毒滴度(TCID50)。結(jié)果顯示,親本病毒的病毒滴度為107.5 mL-1,而重組病毒的病毒滴度為106.5 mL-1,與親本病毒相比滴度顯著下降(P<0.001)。
2.6 重組病毒的穩(wěn)定性鑒定
將純化并鑒定成功的重組病毒在鋪有F81細(xì)胞48孔板中進(jìn)行10 輪傳代,每一代置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后收獲并繼續(xù)傳下一代。結(jié)果(圖5)顯示,從F1—F10,紅色熒光蛋白R(shí)FP都穩(wěn)定表達(dá),無減弱現(xiàn)象,說明FHV-ΔgIgE-RFP可穩(wěn)定表達(dá)外源RFP基因。
圖5 F1—F10代重組病毒FHV-ΔgIgE-RFP RFP蛋白表達(dá)結(jié)果
2.7 重組病毒體外生長(zhǎng)特性分析
用Reed-Muench方法計(jì)算24、48、72和96 h收獲病毒液的TCID50,并用GraphPad Prism軟件繪制病毒生長(zhǎng)曲線。結(jié)果(圖6)顯示:親本病毒H07在24～48 h快速復(fù)制生長(zhǎng),之后復(fù)制速度減緩,而重組病毒整體的生長(zhǎng)趨勢(shì)與H07大致相同,表明本試驗(yàn)的這種基因改造并不會(huì)改變FHV-1本身的生長(zhǎng)特性。
圖6 重組病毒與親本病毒生長(zhǎng)曲線
2.8 重組病毒噬斑觀察及染色結(jié)果
將FHV-ΔgIgE-RFP以及FHV-1 H07接種到鋪滿F81細(xì)胞的6孔板中并加入10 g·L-1低熔點(diǎn)瓊脂糖,培養(yǎng)48 h后在顯微鏡下觀察噬斑形態(tài); 培養(yǎng)72 h后取出,用多聚甲醛固定液進(jìn)行固定后再加入草酸銨結(jié)晶紫染色液進(jìn)行噬斑染色。結(jié)果(圖7)顯示,在病毒感染細(xì)胞前、后期,重組病毒的噬斑都小于親本病毒,說明gIgE基因是FHV-1基因組重要的毒力基因,缺失后毒力降低。
圖7 重組病毒與親本病毒噬斑觀察及染色結(jié)果
3 討論
本研究運(yùn)用同源重組以及CRISPR/Cas9兩種基因編輯技術(shù)構(gòu)建皰疹病毒FHV-1重組病毒,sgRNA結(jié)合Cas9蛋白可靶向使gIgE基因停止轉(zhuǎn)錄、翻譯,降低生物活性,使外源基因RFP更容易將其替換,提高了重組效率。缺失gIgE基因后重組病毒毒力減弱,后續(xù)可利用此生物學(xué)特性構(gòu)建基于此FHV-1重組病毒的二聯(lián)或多聯(lián)致弱苗。例如可以將翻譯狂犬病毒的G糖蛋白、杯狀病毒的VP1蛋白或者貓免疫缺陷病毒的包膜蛋白基因替換RFP,設(shè)計(jì)針對(duì)RFP的sgRNA,利用反向篩選技術(shù),再通過噬斑純化以及有限稀釋去純化無RFP表達(dá)的二聯(lián)或多聯(lián)毒株,為防控貓各種常見且難以控制的病毒性疾病提供借鑒。
純化帶有報(bào)告基因的重組病毒最常用的方法就是噬斑純化,但此方法耗時(shí)長(zhǎng),并且不同種病毒從接種細(xì)胞開始到挑取噬斑的時(shí)間也需要摸索。本試驗(yàn)運(yùn)用的親本病毒株FHV-1 H07挑取噬斑的周期一般為 3 d,如果培養(yǎng)時(shí)間過短則表達(dá)紅色熒光的噬斑較小,此時(shí)挑取極易取到附近的親本病毒,不利于純化; 如果培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng),由于固體培養(yǎng)基的營養(yǎng)已被細(xì)胞消耗殆盡,病毒活力也會(huì)降低,熒光變?nèi)?給挑取噬斑增加了難度。因此把控好試驗(yàn)周期非常重要。在純化過程中發(fā)現(xiàn)FHV-1 H07的生長(zhǎng)速度要遠(yuǎn)高于重組病毒,所以當(dāng)重組病毒的純度達(dá)到80%以上時(shí)就很難有突破,此時(shí)噬斑純化方法就不適用,改為進(jìn)行有限稀釋后的進(jìn)一步純化。將病毒混合液進(jìn)行高度稀釋,就容易獲得與親本病毒完全分離開的重組病毒粒子,后續(xù)只需進(jìn)行幾輪接種培養(yǎng),即可獲得純化的重組病毒。因此,前期做噬斑純化的重組病毒純度越高,后續(xù)做有限稀釋篩選出純化的重組病毒的概率也會(huì)提高,縮短純化時(shí)間。
本研究運(yùn)用同源重組以及CRISPR/Cas9技術(shù)成功構(gòu)建FHV-1 gIgE基因缺失株FHV-ΔgIgE-RFP,并驗(yàn)證此毒株可穩(wěn)定傳代且其毒力降低,而生長(zhǎng)趨勢(shì)與FHV-1親本病毒大致相同。
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