1 材料與方法
1.1 試驗(yàn)材料
1.1.1 細(xì)胞、毒株及試劑
親本病毒株(FHV-1 H07)由浙江迪福潤(rùn)絲生物科技有限公司提供; 貓腎細(xì)胞(F81)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù); Stbl3大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京金沙生物科技有限公司; 瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司; 2×Rapid Taq Master Mix購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司; Body fluid Viral RNA購(gòu)自愛思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司; Lip2000購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司; DEME、胎牛血清購(gòu)自南京生航生物技術(shù)有限公司; 4%多聚甲醛固定液購(gòu)自Phygene Scientific(美國(guó)); 草酸銨結(jié)晶紫染色液購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司; T4連接酶購(gòu)自NEB(美國(guó))。
1.1.2 主要儀器
CO2恒溫培養(yǎng)箱(311)、高速離心機(jī)(LEGEND MICRO 17)購(gòu)于Thermo Scientific公司; 潔凈工作臺(tái)(SW-CG-2FD)購(gòu)于蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司; 基因擴(kuò)增儀(TC-E-480)購(gòu)于杭州博日科技股份有限公司; 熒光顯微鏡(CKX3-SLP)購(gòu)于杭州全譜實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司; 藍(lán)光切膠儀(T-48)購(gòu)于浙江迪福潤(rùn)絲生物科技有限公司; 核酸電泳儀(DYY-6C)購(gòu)于北京六一生物科技有限公司。
1.2 試驗(yàn)方法
1.2.1 FHV-1
gIgE基因左右同源臂序列的獲取 提取親本病毒FHV-1 H07基因組DNA作為模板,根據(jù)GenBank(登錄號(hào) FJ478159.2)C-27株的序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增包含gIgE左同源臂、gIgE基因以及gIgE右同源臂整個(gè)片段的引物,引物序列為gIgE-F/R:aaaacccgatagatacgaagag/cgaataaatgaagaatctaccg,產(chǎn)物大小3 789 bp,將產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,從而獲取gIgE基因左右同源臂的序列。
1.2.2 轉(zhuǎn)移載體的合成
將gIgE基因左右同源臂、紅色熒光蛋白R(shí)FP基因序列送至金唯智生物科技有限公司,合成針對(duì)gIgE基因的轉(zhuǎn)移載體,命名為pUC-gIgE-L-RFP-R。
1.2.3 sgRNA質(zhì)粒的構(gòu)建
設(shè)計(jì)3條針對(duì)gIgE基因的sgRNA,引物序列如表1所示。使用T4聚合酶將sgRNA-oligo退火成雙鏈,通過PCR合成sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3片段。將質(zhì)粒pX458-Neo R進(jìn)行酶切,酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并回收,使用T4連接酶與3個(gè)sgRNA片段進(jìn)行室溫過夜連接后轉(zhuǎn)化至Stbl3大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中,將測(cè)序正確的菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取。
表1 sgRNA引物信息
1.2.4 重組病毒的構(gòu)建
使用Lip2000將2 μg轉(zhuǎn)移載體pUC-gIgE-L-RFP-R和3條sgRNA(各0.5 μg)轉(zhuǎn)染至生長(zhǎng)狀態(tài)良好的單層F81細(xì)胞6孔板中,并將親本病毒FHV-1 H07按MOI=0.1的接毒量感染細(xì)胞。6孔板置于CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后,在熒光顯微鏡下觀察有無紅色熒光蛋白(RFP)表達(dá),將細(xì)胞培養(yǎng)混合液凍融1次后吸取上清液,按10-1～10-6稀釋度分別接種F81細(xì)胞6孔板,接種6 h后于每孔加入30 ℃、1.5 mL 10 g·L-1低熔點(diǎn)瓊脂糖(20 g·L-1低熔點(diǎn)瓊脂糖與20 g·L-1FBS DMEM培養(yǎng)基按體積比為1:1的比例混合)。待瓊脂糖冷卻凝固后置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h,在熒光顯微鏡下挑取表達(dá)RFP的噬斑,洗脫到500 μL 20 g·L-1 FBS DMEM培養(yǎng)基中。將噬斑洗脫液凍融1次后再分別按10-1～10-6稀釋度接種F81細(xì)胞,培養(yǎng)并挑取噬斑。反復(fù)此操作直到顯微鏡中視野下表達(dá)RFP的細(xì)胞病變占總細(xì)胞病變的80%～90%時(shí),將噬斑洗脫液進(jìn)行有限稀釋,按10-6～10-8稀釋度分別接種F81細(xì)胞。每個(gè)稀釋度接種96孔板,每孔100 μL病毒液,置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。72 h后在顯微鏡下篩選細(xì)胞病變處有RFP表達(dá)的單個(gè)孔,96和120 h再次觀察篩選出來的單個(gè)孔是否有野毒生長(zhǎng)。最終將篩選出來的單個(gè)孔中的培養(yǎng)物凍融1次,12 000 r·min-1離心2 min,吸取上清液并保存。
1.2.5 重組病毒的鑒定
將篩選出的重組病毒進(jìn)行測(cè)序。設(shè)計(jì)分別用于驗(yàn)證RFP和gIgE的引物對(duì),引物序列如表2所示。提取重組病毒的基因組作為模板進(jìn)行PCR,以親本病毒H07的結(jié)果作為對(duì)照,將進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后有目的條帶的PCR原液測(cè)序。
表2 鑒定重組病毒的引物
1.2.6 重組病毒與親本病毒組織半數(shù)感染量(TCID50)的測(cè)定
將重組病毒與親本病毒原液從10-1稀釋到10-10,接種到含生長(zhǎng)狀態(tài)良好的F81細(xì)胞的96孔板中,每孔100 μL病毒液,每個(gè)稀釋度3個(gè)重復(fù),置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后在熒光顯微鏡下記錄每個(gè)稀釋度有熒光或有細(xì)胞病變的孔數(shù),用Reed-Muench方法計(jì)算重組病毒與親本病毒的TCID50。
1.2.7 重組病毒的穩(wěn)定性分析
將重組病毒在鋪滿F81細(xì)胞的48孔板中進(jìn)行傳代觀察。48 h后待所有細(xì)胞都完全病變時(shí),將培養(yǎng)液凍融1次并繼續(xù)傳下一代。從F1傳至F10,每一代均需在熒光顯微鏡下觀察重組病毒RFP的表達(dá)情況。
1.2.8 重組病毒的體外生長(zhǎng)特性分析
在鋪有F81細(xì)胞48孔板中每孔以250 TCID50接毒量接種重組病毒以及H07病毒液,分別在24、48、72和96 h收獲。每種病毒液在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)3個(gè)重復(fù)孔,用Reed-Muench方法計(jì)算收獲的所有病毒液的TCID50,最后用GraphPad Prism軟件繪制病毒生長(zhǎng)曲線。
1.2.9 噬斑觀察及染色
在鋪有F81細(xì)胞6孔板中接種重組病毒以及H07病毒液,接種6 h后于每孔加入30 ℃、1.5 mL 10 g·L-1低熔點(diǎn)瓊脂糖。待瓊脂糖冷卻凝固后置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后在熒光顯微鏡下觀察噬斑形態(tài); 培養(yǎng)72 h后向每孔加入1 mL多聚甲醛固定液,靜置30 min后吸出,再加入1 mL草酸銨結(jié)晶紫染色液靜置20 min。用鑷子小心將孔中的瓊脂糖膠塊去除,清水多次小心清洗,待孔中每個(gè)噬斑清晰可見時(shí)拍照并計(jì)數(shù)。
1.3 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析
采用GraphPad Prism 8.0軟件繪圖,應(yīng)用SPSS 25.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和t測(cè)驗(yàn)。
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