2結(jié)果與分析
2.1 Sprodbtg基因的擴(kuò)增
本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的質(zhì)粒pET28a-prodbtg中目的基因未發(fā)生突變，以該質(zhì)粒作為模板，分別用引物P1、R1和P2、R1擴(kuò)增基因Sprodbtg.PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，獲得約為1,100,bp的目的片段（圖1），其大小與Sprodbtg預(yù)計(jì)大小相符，表明Sprodbtg擴(kuò)增成功。該基因上游外源加入了一段SD序列及C.glutamicum高效分泌蛋白的信號(hào)肽序列ΔS0949，使得prodbtg具有了在C.glutamicum中分泌表達(dá)的潛力。
2.2重組質(zhì)粒pXMJ19-Sprodbtg的構(gòu)建
將PCR產(chǎn)物切膠回收后用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切，后與同樣經(jīng)過HindⅢ和BamHⅠ雙酶切的質(zhì)粒pXMJ19連接，然后轉(zhuǎn)化至E.coli JM109，涂布含氯霉素質(zhì)量濃度為50,μg/mL的平板。經(jīng)篩選挑取陽(yáng)性菌落活化后提取質(zhì)粒，用HindⅢ和BamHⅠ雙酶切驗(yàn)證，同時(shí)將pXMJ19空質(zhì)粒用HindⅢ進(jìn)行單酶切作為對(duì)照，結(jié)果如圖2所示?？召|(zhì)粒經(jīng)HindⅢ單酶切獲得約6,600,bp的片段，重組質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ和BamHⅠ雙酶切獲得約6,600,bp和1,100,bp的兩條帶，其中大片段與空質(zhì)粒pXMJ19大?。?,600,bp）相符，小片段與目的基因Sprodbtg大小相符，表明Sprodbtg基因已成功連接到表達(dá)載體上。
2.3谷氨酸棒桿菌的電轉(zhuǎn)化及鑒定
提取重組質(zhì)粒pXMJ19-Sprodbtg并電擊轉(zhuǎn)化谷氨酸棒桿菌感受態(tài)細(xì)胞，以空質(zhì)粒pXMJ19作為對(duì)照菌株。涂布于含氯霉素10,μg/mL的LA抗性平板，挑取轉(zhuǎn)化子酶切驗(yàn)證。
2.4重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)
按照1.2.4方法對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，將誘導(dǎo)48,h后的重組菌株C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19-Sprodbtg和對(duì)照菌株C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19發(fā)酵液經(jīng)TCA沉淀濃縮后進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖3所示。
圖3重組谷氨酸棒桿菌發(fā)酵上清液SDS-PAGE分析
泳道1陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子C.glutamicum ATCC 13032/pXMJ19-Sprodbtg在大約3.8×104處出現(xiàn)1條特異性蛋白條帶，其大小與預(yù)測(cè)的proD-BTG的相對(duì)分子質(zhì)量一致。泳道2中對(duì)照菌C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19未見相應(yīng)目的蛋白條帶，從而初步說明proD-BTG在谷氨酸棒桿菌中被成功分泌表達(dá)。
2.5酶原蛋白proD-BTG的酶活力測(cè)定
重組菌C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19-Sprodbtg表達(dá)酶原蛋白proD-BTG經(jīng)Factor Xa切割后，熒光法測(cè)定酶活力，結(jié)果顯示BTG活力為（41.23±2.01）U/L。
2.6重組菌C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19-Sprodbtg誘導(dǎo)條件優(yōu)化
2.6.1生長(zhǎng)曲線的繪制
重組菌在氯霉素濃度為10μg/mL的MMTG培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線如圖4所示。由圖4可知：重組菌株4,h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，14,h后生長(zhǎng)減緩，18 h后進(jìn)入穩(wěn)定期。
2.6.2誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)目的蛋白proD-BTG表達(dá)的影響
取不同誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的發(fā)酵液添加Factor Xa并測(cè)定重組菌BTG的活力，結(jié)果如圖5所示。在培養(yǎng)4 h后進(jìn)行誘導(dǎo)，目的蛋白在重組菌中表達(dá)量非常低；然后隨著菌體密度的增大而進(jìn)行誘導(dǎo)，目的蛋白的表達(dá)量也隨之增加。在培養(yǎng)12 h（A600約為2.2）時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)達(dá)到最高酶活力（47.43±2.34）U/L，此時(shí)為重組菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的中后期，目的蛋白的表達(dá)量基本達(dá)到最大，之后表達(dá)量開始下降，這可能是后期培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)被大量消耗，缺乏充足的營(yíng)養(yǎng)用于目的蛋白的合成，因此當(dāng)培養(yǎng)12,h后開始誘導(dǎo)，為最適的誘導(dǎo)時(shí)機(jī)。
圖4 C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19-Sprodbtg生長(zhǎng)曲線
圖5不同誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)proD-BTG蛋白表達(dá)的影響
2.6.3誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)目的蛋白proD-BTG表達(dá)的影響
如圖6所示，當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間為10——40 h時(shí)，目的蛋白的表達(dá)量隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加而增加，最高達(dá)到（54.69±3.35）U/L；而當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間超過40 h后，表達(dá)量有所下降，推測(cè)可能由于菌體開始進(jìn)入衰亡期，裂解的菌體釋放出的蛋白酶降解了部分重組蛋白，導(dǎo)致重組蛋白表達(dá)量的下降。所以最佳誘導(dǎo)時(shí)間定為40 h.
圖6不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)proD-BTG蛋白表達(dá)的影響
2.6.4 IPTG濃度對(duì)目標(biāo)蛋白proD-BTG表達(dá)的影響
IPTG對(duì)細(xì)胞有一定的毒性，所以加入合適濃度的IPTG，才能使目的蛋白得到高效表達(dá)。IPTG濃度在0.01——5.0,mmol/L的范圍內(nèi)可能對(duì)表達(dá)產(chǎn)生影響。IPTG濃度對(duì)目標(biāo)蛋白proD-BTG表達(dá)的影響如圖7所示。
圖7不同IPTG濃度對(duì)proD-BTG蛋白表達(dá)的影響
當(dāng)IPTG濃度為0.4——0.8 mmol/L時(shí)，目的蛋白的表達(dá)量隨著IPTG濃度的增加而增加，最高達(dá)到（55.62±2.34）U/L；當(dāng)IPTG濃度增大到1.0 mmol/L時(shí)，目的蛋白的表達(dá)量也能達(dá)到最高，但考慮到成本的節(jié)約，將0.8 mmol/L作為IPTG的最優(yōu)誘導(dǎo)濃度。
3結(jié)語(yǔ)
本文在前期研究的基礎(chǔ)上，對(duì)谷氨酸棒桿菌重組菌株C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19-Sprodbtg的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。重組菌培養(yǎng)12 h后A600約為2.2時(shí)，添加IPTG至終濃度為0.8 mmol/L，誘導(dǎo)40 h.優(yōu)化后的發(fā)酵上清液酶活力由（41.23±2.01）U/L提高到（55.62±2.34）U/L，比優(yōu)化前提高了約34.90%,，為BTG進(jìn)一步的高效制備奠定了基礎(chǔ)。
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