1.3.5蛋白水解活力的測定


蛋白水解活力測定。取2 mL 1.5%酪蛋白溶液于35℃保溫5 min，加入0.5 mL預(yù)熱好的待測酶液混勻后繼續(xù)水浴恒溫放置60 min，然后加入2 mL 8%的三氯乙酸終止反應(yīng)，將沉淀過濾后測定濾液在280 nm波長處的吸光度，記為A1。制備空白樣品時(shí)，先取0.5 mL待測酶液直接與8%的三氯乙酸混合，使其立刻終止反應(yīng)，后加入2 mL 1.5%酪蛋白溶液，重復(fù)過濾步驟，濾液作為空白對照，測定其在280 nm波長處的吸光度，記為A2。


本實(shí)驗(yàn)條件下，60 min引起A280nm增加0.001所需的酶量為1個(gè)酶活力單位，按公式（2）計(jì)算：


1.3.6產(chǎn)凝乳酶菌株的鑒定


1.3.6.1形態(tài)學(xué)觀察


將產(chǎn)凝乳酶優(yōu)勢菌在LB固體平板上劃線，于30℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2～3 d后觀察菌落生長情況及菌落形態(tài)。將菌體進(jìn)行芽孢染色及革蘭氏染色后于高倍顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。


1.3.6.2 API試劑條法對菌株鑒定


將平板中培養(yǎng)好的新鮮菌體用無菌生理鹽水溶解，根據(jù)API 50 CHB比濁法達(dá)到菌體濃度要求，然后分別加入API 50 CHB試劑盒各孔內(nèi)，37℃靜置培養(yǎng)24 h和48 h，觀察試劑盒各孔顏色的變化。


1.3.6.3菌株16S rDNA序列擴(kuò)增與分析


采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌DNA，根據(jù)上述菌株鑒定所得由桿菌科的16S rDNA序列設(shè)計(jì)引物：正向引物P1：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；反向引物P2：5’-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’。以菌株基因組DNA作為PCR擴(kuò)增的模板，PCR體系（20μL）為：上下游引物各1μL、DNA模板1μL、超純水7μL、TaqDNA聚合酶10μL。PCR參數(shù)為：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性0.5 min，55℃退火0.5 min，72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；70℃末端延伸10 min，4℃保存。取5μL產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，將大小正確的目的片段送至北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司測序。將測序結(jié)果提交到GenBank中選取相關(guān)菌株的16S rDNA基因序列進(jìn)行比對分析，選取相似性較高的序列，與實(shí)驗(yàn)菌株一起用軟件MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。


1.3.7產(chǎn)凝乳酶菌株生長曲線和產(chǎn)酶活力曲線的的測定


1.3.7.1生長曲線的測定


從產(chǎn)凝乳酶菌株的平板中挑取少量菌體接種于已滅菌的液體LB培養(yǎng)基中，30℃、120 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)30 h，從2 h起每隔2 h測定菌體OD600nm值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，繪制菌株生長曲線。


1.3.7.2酶活力曲線的測定


挑取少量LB-51菌體接入液體LB培養(yǎng)基中，30℃、120 r/min條件下恒溫振蕩12 h，作為活化種子液；以3%的接種量接種于已滅菌的LB液體培養(yǎng)基中，裝液量為體積分?jǐn)?shù)40%，30℃、120 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)0、12、24、36、48、60、72、84、96 h時(shí)，分別按照1.3.4和1.3.5節(jié)方法測定凝乳活力和蛋白水解活力，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，繪制菌株產(chǎn)酶活力曲線圖。


1.3.8菌株發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶及其分離提取


將活化的菌液以3%的接種量接種到已滅菌的LB液體培養(yǎng)基中，30℃、120 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)72 h。發(fā)酵液經(jīng)8 000 r/min離心30 min以去除菌體，上清液放置于4℃冰箱內(nèi)冷卻2 h。向4℃的發(fā)酵液中加入預(yù)冷的無水乙醇，使混合后的乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，迅速攪拌均勻，于4℃冰箱中靜置過夜，4℃、10 000 r/min離心30 min，沉淀用0.005 mol/L的pH 5.8的磷酸鹽緩沖液溶解以防止蛋白質(zhì)凝聚或變性，溶解液放置在4℃冰箱中冷藏，之后于4℃條件下透析除鹽并冷凍干燥成酶粉。


1.3.9凍干凝乳酶的凝乳活性評價(jià)


取0.01 g粗酶凍干粉于5 mL去離子水中，充分溶解后按照1.3.4節(jié)方法測定凝乳活力，根據(jù)公式（1）換算粗酶的單位酶活力，并與商業(yè)凝乳酶做對比。


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