8．噬菌體基因組組分分析及功能注釋
全基因組測序結(jié)果顯示(圖7)，噬菌體JD01基因組全長為44 880 bp，G＋C含量為50.17%，含有63個(gè)開放閱讀框架(open reading frame，ORF)，其中正向的有20個(gè)，反向的有43個(gè)。其中推定為已知功能的ORF有24個(gè)，其余都為未知功能的假定蛋白，無tRNA。噬菌體JD01的基因組信息上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號(hào)為MW715619。編碼功能蛋白的基因主要分為5個(gè)功能模塊：(1)功能代謝模塊：這個(gè)模塊主要是DNA代謝所需要的各種酶，例如DNA引物酶、聚合酶、核苷酸內(nèi)切酶等。包括DNA結(jié)合蛋白(ORF2、ORF43、ORF63)、DNA解旋酶(ORF36、ORF48)、核酸內(nèi)切酶(ORF44)。
(2)包裝蛋白模塊：包括末端酶大亞基(ORF19)和末端酶小亞基(ORF18)，噬菌體JD01的末端酶大亞基與沙門菌噬菌體vB_SpuP_Spp11的同源性高達(dá)98.82%，小亞基與沙門菌噬菌體SE2的同源性高達(dá)98.57%，而且這兩個(gè)噬菌體均屬于Jerseyvirus屬。
(3)結(jié)構(gòu)蛋白模塊：噬菌體JD01的結(jié)構(gòu)蛋白基因主要分布在序列的起始和末尾處，大部分編碼結(jié)構(gòu)蛋白的基因都位于正鏈上，如編碼頭部形態(tài)發(fā)生蛋白基因位于基因序列的前端(ORF16)，衣殼蛋白編碼在其左右(ORF11、ORF12)，其中頸須蛋白(ORF10、ORF15)共同組織和拼接了一個(gè)頭部模型。在基因組序列后部的尾刺蛋白(ORF52)和尾纖維蛋白(ORF53)，位于基因序列的前端尾蛋白(ORF3)，卷尺蛋白(ORF57)，重復(fù)感染免疫蛋白(ORF60)均位于負(fù)鏈上。
(4)宿主裂解相關(guān)模塊：噬菌體JD01的裂解模塊由NinH-like裂解蛋白(ORF23)，uvsX-like裂解蛋白(ORF29)，穿孔素樣Ⅰ類裂解蛋白(ORF36)組成，目前研究認(rèn)為，噬菌體的主要裂解系統(tǒng)就是由holin-lysin樣蛋白發(fā)揮作用機(jī)制，holin是一種穿孔素，負(fù)責(zé)在細(xì)菌細(xì)胞膜上打孔將其穿透，精準(zhǔn)把控裂解的時(shí)間，lysin是一種酶促蛋白，負(fù)責(zé)細(xì)菌細(xì)胞壁的降解，二者相互配合，從進(jìn)入到釋放，從內(nèi)而外的將宿主菌裂解并進(jìn)行自我增殖。(5)其他功能蛋白模塊：這一模塊主要是一些尚未清楚具體功能的蛋白質(zhì)，需進(jìn)一步挖掘其作用。
在VFDB、CARD和過敏原數(shù)據(jù)庫中未檢索到噬菌體JD01中存在毒力基因、耐藥基因和過敏原基因。
圖7腸炎沙門菌噬菌體JD01基因組注釋圖譜
9．噬菌體JD01的進(jìn)化分析
基于噬菌體JD01的全基因組序列，使用MEGA 7.0軟件，對噬菌體JD01做進(jìn)化關(guān)系分析，在NCBI的BLAST中檢索噬菌體JD01的親緣性較高的噬菌體，根據(jù)它們的全基因組序列建立系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果如圖8所示，噬菌體JD01與Jerseyvirus屬沙門菌噬菌體vB SenS Psm105、沙門菌噬菌體vB SenS Psm147、沙門菌噬菌體vB SenS Psm140具有較近的親緣關(guān)系，均屬于有尾噬菌體綱(Caudoviricetes)、Guernseyvirinae科、Jerseyvirus屬，因此噬菌體JD01是Jerseyvirus屬中的一個(gè)種，2023年國際病毒命名委員會(huì)(International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)命名為Jerseyvirus JD01。
圖8腸炎沙門菌噬菌體JD01的進(jìn)化關(guān)系分析
10．噬菌體JD01比較基因組學(xué)分析
按照國際病毒分類委員會(huì)分類鑒定新病毒的基本參數(shù)，基因序列同源性超過50%可定義為一個(gè)屬。根據(jù)NCBI核苷酸數(shù)據(jù)庫BLASTN測定，噬菌體JD01的基因組與沙門菌噬菌體vB SenS Psm105相似性為97.87%，與沙門菌噬菌體vB SenS Psm147相似性為96.39%，與沙門菌噬菌體vB SenS Psm140相似性為96.27%，與沙門菌噬菌體vB SenS SP8相似性為96.26%，這4株沙門菌噬菌體均為Jerseyvirus屬。BLASTN是傳統(tǒng)方法用于基因組之間相似性的比較，只用于成對樣品的比較，不適用于比較較大的數(shù)據(jù)庫，而VIRIDIC是標(biāo)準(zhǔn)化和高通量的病毒基因組比較工具，改進(jìn)了傳統(tǒng)BLASTN方法，用于計(jì)算和可視化病毒基因組間相關(guān)性。由VIRIDIC熱圖(圖9)可見噬菌體JD01與Jerseyvirus屬的其他成員的平均核苷酸同一性(average nucleotide identity，ANI)>80%。ANI已被用于在基因組水平評估物種之間的遺傳關(guān)系。屬分界的ANI值平均為73.98%[15]，因此強(qiáng)烈表明噬菌體JD01是Jerseyvirus屬的一個(gè)成員。圖10顯示噬菌體JD01與Jerseyvirus屬沙門菌噬菌體f18SE、wksl3、SE2、SS3e、SP101和Jersey基因組大量共線，但是存在著基因組的重排。
圖9 VIRIDIC比較噬菌體基因組相似性
注：A:沙門菌噬菌體f18SE;B:腸炎沙門菌噬菌體JD01；C～G:分別為沙門菌噬菌體wksl3、SE2、SS3e、SP101和Jersey
圖10腸炎沙門菌噬菌體JD01與其他沙門菌噬菌體基因共線性分析
11．不同溫度下噬菌體JD01對污染蛋液的殺菌效果：
如圖11所示，4℃條件下噬菌體JD01處理組細(xì)菌濃度在2 h內(nèi)下降了約0.8 lg(CFU/ml)，作用12 h后，細(xì)菌的濃度降低了約2.5 lg(CFU/ml)，殺菌效果明顯；25℃下，2 h之內(nèi)下降了約2.2 lg(CFU/ml)，作用12 h下降了約4.5 lg(CFU/ml)；提示噬菌體JD01在25℃條件下對污染蛋液的殺菌效果優(yōu)于4℃。
圖11噬菌體JD01的殺菌效果
結(jié)果與結(jié)論
腸炎沙門菌噬菌體JD01頭部為(58±3)nm的二十面體，尾部長度為(120±5)nm，帶有約17 nm的薄底板，尾端有5～6個(gè)尖刺。噬菌體JD01基因組全長44 880 bp，G＋C含量為50.17%，預(yù)測有63個(gè)開放閱讀框，無tRNA，基因比對分析和系統(tǒng)發(fā)育分析表明噬菌體JD01為全新噬菌體，歸類于有尾噬菌體綱(Caudoviricetes)，Guernseyvirinae科，Jerseyvirus屬，在噬菌體基因組中均未發(fā)現(xiàn)已知的毒力基因和耐藥基因。噬菌體JD01在70℃以下、pH為4.0～12.0的條件下存活，且裂解細(xì)菌具有屬的特異性；噬菌體JD01對污染雞蛋液中的腸炎沙門菌具有良好的殺菌效果。噬菌體JD01裂解性強(qiáng)，宿主范圍廣，在食品安全和控制腸炎沙門菌污染方面具有較大潛力，可以用于食品安全生物防控制劑的開發(fā)。
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