1.2.2生長(zhǎng)曲線測(cè)定
在超凈臺(tái)中挑取純化后的單菌落接種于TSB液體培養(yǎng)基（含10μg/mL NAD溶液）中，置于37℃搖床，180 r/min培養(yǎng)過(guò)夜，次日按照1%比例（體積比）轉(zhuǎn)接于新TSB液體培養(yǎng)基（含10μg/mL NAD溶液）中，再放置于37℃搖床，180 r/min培養(yǎng)，分別在0、2、4、6、8、10和12 h時(shí)間點(diǎn)取出100μL菌液測(cè)定OD600nm值。
1.2.3溶血活性測(cè)定
將無(wú)菌綿羊血按照體積比5%比例加入TSA培養(yǎng)基（含10μg/mL NAD溶液）中，配制綿羊血平板。挑取臨床單個(gè)菌落均勻地點(diǎn)在培養(yǎng)基上，每個(gè)菌4個(gè)重復(fù)，隨后將平皿倒置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18~24 h，觀察是否有溶血情況以及溶血環(huán)大小。
1.2.4耐藥性檢測(cè)
從-20℃取出抗生素貯存液，解凍混勻后，取適量MH培養(yǎng)基稀釋至適宜濃度。梯度稀釋抗生素（第1孔200μL，其余各孔100μL MH培養(yǎng)基），第11孔加入菌液，第12孔為對(duì)照。每孔加入100μL菌液混勻，終濃度約5×105 CFU/mL。96孔板中，每孔中加入1×108 CFU/mL菌液100μL。37℃培養(yǎng)24 h后，根據(jù)2020版美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI）中的標(biāo)準(zhǔn)，首個(gè)澄清孔抗生素濃度為MIC（最小抑菌濃度），參考流感/副流感嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)分析。
1.2.5大蠟螟模型初步篩選疫苗候選菌株
本研究使用大蠟螟和小鼠模型對(duì)分離菌株進(jìn)行毒力篩選，首先用大蠟螟模型對(duì)菌株數(shù)量較多的血清1型、7型進(jìn)行篩選，其他血清型菌株數(shù)量較少，直接進(jìn)行后續(xù)小鼠篩選試驗(yàn)。將0.4~0.5 g大蠟螟幼蟲(chóng)分組，每組10只，注射APP血清型1型和7型菌液，設(shè)生理鹽水組和空白對(duì)照組。注射劑量25μL/只，約1.0×106 CFU/只，37℃避光培養(yǎng)24 h，記錄死亡情況（通體變黑且不動(dòng)為死亡）。試驗(yàn)重復(fù)2次。初步篩選出毒力較強(qiáng)的血清1型和7型菌株。
1.2.6小鼠模型篩選高毒力疫苗候選菌株
將78只4周齡KM雌鼠隨機(jī)分為13組，每組6只，采用腹腔注射進(jìn)行感染，其中4組感染1型菌株（6×106 CFU/只），2組感染7型菌株（8×108 CFU/只），4組感染15型菌株（4×108 CFU/只），3組感染5型菌株（1×107 CFU/只）。觀察3 d，統(tǒng)計(jì)小鼠死亡率和癥狀，選擇各血清型毒力最強(qiáng)的菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。
1.2.7疫苗候選菌株LD50（半數(shù)致死量）測(cè)定
將120只4周齡昆明雌鼠隨機(jī)分成20組，每組6只。血清型1型菌株3-7選用1.6×107、8×106、4×106、2×106和1×106 CFU/只5個(gè)劑量進(jìn)行攻毒；血清型5型菌株4-3選用4×107、2×107、1×107、5×106和2.5×106 CFU/只5個(gè)劑量進(jìn)行攻毒。血清型7型菌株選用5×108、1.3×108、3×107、7.8×106和2×106 CFU/只5個(gè)劑量進(jìn)行攻毒；血清型15型菌株選用1×109、5×108、2.5×108、1.3×108和6×107 CFU/只5個(gè)劑量進(jìn)行攻毒。
同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，注射等量生理鹽水，均采用腹腔注射的攻毒方式，攻毒后觀察3 d，統(tǒng)計(jì)死亡率，根據(jù)改進(jìn)寇氏法計(jì)算LD50，計(jì)算公式為L(zhǎng)D50＝lg-1［Xm-i（∑P-0.5）］（Xm—最大劑量的對(duì)數(shù)；i—組間距相鄰兩組對(duì)數(shù)劑量的差值；P—各組動(dòng)物的死亡率；∑P—各組動(dòng)物死亡率的總和）。
1.2.8疫苗候選菌株滅活疫苗的制備及免疫
將候選菌株進(jìn)行復(fù)蘇并傳代，在TSB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期，6 000 r/min離心5 min，PBS洗3次后用PBS重懸。按總體積加入0.4%甲醛溶液，于37℃180 r/min振蕩滅活24~48 h。滅活后取滅活菌液進(jìn)行TSA平板劃線，同時(shí)進(jìn)行TSB培養(yǎng)基液體培養(yǎng)，進(jìn)行滅活效果檢測(cè)。根據(jù)試驗(yàn)設(shè)定的免疫劑量（單價(jià)疫苗劑量為菌株LD100的兩倍；用PBS調(diào)整濃度，與鋁佐劑1∶1配比，制成滅活疫苗，置4℃保存?zhèn)溆?。使?周齡Balb/c雌鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，試驗(yàn)分組見(jiàn)表2。首次免疫記為第0天，第13天小鼠采血分離血清，第14天進(jìn)行二免，第27天小鼠采血分離血清，第28天進(jìn)行攻毒（各血清型候選菌株的LD100）。期間觀察各組小鼠精神狀況及死亡情況。同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照和商品化疫苗對(duì)照（豬傳染性胸膜肺炎三價(jià)滅活疫苗），商品化疫苗含有1、2、7型菌，且每種菌抗原含量均≥5×108 CFU/mL，即≥1×108 CFU/只。
表2滅活疫苗免疫程序及免疫劑量
1.2.9抗體水平檢測(cè)
全菌蛋白制備：將候選菌株進(jìn)行培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，收集菌體并用PBS重懸，超聲破碎后離心取上清即為全菌蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度后液氮速凍保存。將候選菌株的全菌蛋白用包被液包被后，ELISA板中每孔加入100μL，4℃包被過(guò)夜。棄去包被液，每孔加200μL PBST洗滌液清洗3次。每孔加入300μL脫脂乳封閉液，37℃封閉2 h。棄去封閉液，PBST洗滌液清洗3次。每個(gè)樣品用PBST將其稀釋160倍后每孔加入100μL，37℃孵育1 h。棄一抗，PBST洗滌液清洗3次。用PBST按1∶3 000稀釋羊抗鼠酶標(biāo)二抗，每孔100μL，37℃孵育1 h。棄二抗，PBST洗滌液清洗3次。每孔加入100μL TMB底物顯色液，37℃避光顯色20 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD630nm處的吸光度。
1.2.10疫苗候選株傳代穩(wěn)定性檢測(cè)
將篩選出的候選菌株接種于TSB液體培養(yǎng)基中，置于37℃搖床，180 r/min培養(yǎng)過(guò)夜，次日按照1%比例（體積比）轉(zhuǎn)接于新TSB液體培養(yǎng)基中，再放置于37℃搖床，180 r/min培養(yǎng)。12 h后按1%比例（體積比）轉(zhuǎn)接于新TSB液體培養(yǎng)基，為傳代一次，按照此操作連續(xù)傳代30次，使用候選菌株的10代、20代、30代菌株分別以致死劑量感染小鼠，每組6只，觀察小鼠存活情況。
1.2.11數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
本文所采用的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均使用GraphPad Prism 8.0軟件計(jì)算各組數(shù)據(jù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，采用t檢驗(yàn)對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。P>0.05為差異不顯著（ns），P<0.05為差異顯著(*)，P<0.01為差異極顯著(**)，P<0.001為差異極顯著(***)。
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