摘要：文章從健康嬰兒糞便樣品中篩選得到8株具有凝乳能力且產(chǎn)蛋白酶能力強(qiáng)的乳桿菌（均為鼠李糖乳酪桿菌）。除對(duì)照菌副干酪乳酪桿菌CICC 6110外，所有試驗(yàn)菌株和對(duì)照菌鼠李糖乳酪桿菌GG（LGG）在pH 2.5時(shí)均表現(xiàn)較強(qiáng)的耐受性；菌株N33、N38、T91和T95在0.2%膽鹽環(huán)境下表現(xiàn)較強(qiáng)的耐受能力；H48、T91和T95菌株分泌的胞外多糖產(chǎn)量高，均超過400 mg/L；除N33外其余菌株均具有較強(qiáng)的自聚集能力。結(jié)果表明，S29、N38、H48、T91以及T95是綜合能力較強(qiáng)的菌株，具有極其優(yōu)良的益生特性，發(fā)現(xiàn),菌株S21的形態(tài)結(jié)構(gòu)與其他菌株不同。研究為益生菌產(chǎn)業(yè)提供了潛在的菌株資源。
引言
益生菌定義為“當(dāng)給予足夠數(shù)量時(shí)，對(duì)宿主健康有益的活性微生物”。近年來，益生菌已成為食品和健康領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。益生菌不僅有助于促進(jìn)營養(yǎng)吸收、增強(qiáng)人體免疫功能、維持腸道微生態(tài)平衡及保護(hù)黏膜屏障，還能發(fā)揮抗感染、抗癌、輔助治療過敏性疾病等多種功效。至今為止，已從哺乳動(dòng)物糞便、陰道分泌物、傳統(tǒng)發(fā)酵制品等來源中分離出40余種不同的乳酸桿菌，如植物乳植桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳酪桿菌和羅伊氏粘液乳桿菌等，這些共同構(gòu)成了乳酸桿菌家族。
蛋白酶在食品工業(yè)領(lǐng)域中的應(yīng)用極大促進(jìn)了富含多肽或必需氨基酸食品的生產(chǎn)。這些食品對(duì)于增強(qiáng)人體對(duì)蛋白質(zhì)消化與吸收能力具有顯著作用。腸道內(nèi)存在一定種類的高產(chǎn)蛋白酶微生物群落，它們的存在顯著提升了食物中蛋白質(zhì)消化率，并可作為潛在的膳食補(bǔ)充劑提高機(jī)體免疫力。
目前，蛋白酶主要來源包括動(dòng)物、植物和微生物。其中，動(dòng)物和植物來源的蛋白酶種類較少，而細(xì)菌和真菌來源的蛋白酶因菌株生長迅速、生產(chǎn)成本較低廉、酶種類豐富以及適應(yīng)性廣等優(yōu)點(diǎn)而受關(guān)注。產(chǎn)蛋白酶的細(xì)菌主要有乳酸桿菌和芽胞桿菌，然而目前報(bào)道的產(chǎn)酶菌種資源有限，難以滿足工業(yè)化對(duì)各類蛋白酶的生產(chǎn)需求。本文通過高效的篩選方法，在健康嬰兒糞便樣品中分離鑒定高產(chǎn)蛋白酶乳酸桿菌。同時(shí)，通過模擬胃液、膽鹽耐受性、自聚集能力和表面疏水能力等試驗(yàn)，對(duì)所篩選產(chǎn)蛋白酶的乳酸桿菌益生特性進(jìn)行初步探究，為其作為益生菌應(yīng)用于食品領(lǐng)域提供理論參考。
1材料與方法
1.1材料與試劑
試驗(yàn)樣品來自16名健康嬰兒糞便。嬰兒月齡均為6個(gè)月以內(nèi)、全母乳喂養(yǎng)，由28~32歲健康母親自然分娩，且在采樣前2周內(nèi)未服用抗生素或益生菌。所采集樣本均來自黑龍江省。對(duì)照菌副干酪乳酪桿菌CICC 6110（LP_6110）和鼠李糖乳酪桿菌GG ATCC 53103（LGG）購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。
MRS培養(yǎng)基（20221215），青島海博生物技術(shù)有限公司；吐溫80（20230401），天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；磷酸鹽緩沖液（20231016）、50×TAE緩沖液（20230517）、革蘭氏染色試劑盒（20230918），北京索萊寶科技有限公司；瓊脂（20220203），德國BioFroxx公司；三氯乙酸（20220919），天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；胃蛋白酶（20220523）、胰蛋白酶（20230806），天津阿爾法生物科技有限公司；豬膽鹽（20230314），美國Sigma公司；無水乙醇（20230515）、二甲苯（20221115），天津市富宇精細(xì)化工有限公司；GelRed核酸染料BS354A（20230217），北京蘭杰柯科技有限公司；引物（20230914），生工生物工程（上海）股份有限公司；DNA提取試劑盒（20221129）、2×Master Mix（20230611）、6×Loading Buffer（20230811），天根生化科技（北京）有限公司。
1.2儀器與設(shè)備
DL-CJ-2NDI超凈工作臺(tái)，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；TGL-23高速冷凍離心機(jī)，四川蜀科儀器有限公司；GR85DA立式壓力蒸汽滅菌鍋，致微（廈門）儀器有限公司；PB-10臺(tái)式pH計(jì)，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；DYY-10C型電泳儀，北京市六一儀器廠；Analytic Jena 96型PCR儀，Biometra GmbH公司；CMax Plus酶標(biāo)儀，美谷分子儀器（上海）有限公司；Bioscreen C生長曲線測(cè)定儀，美國AB公司。
1.3試驗(yàn)方法
1.3.1產(chǎn)蛋白酶乳桿菌的篩選
用還原液（10 g/L細(xì)菌蛋白胨，5 g/L氯化鈉，0.5 g/L L-Cysteine HCl，1 mL/L吐溫80）對(duì)糞便樣品進(jìn)行稀釋后涂布在LAMVAB固體培養(yǎng)基表面，對(duì)菌落進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢和H2O2酶試驗(yàn)，選出目標(biāo)菌種劃線培養(yǎng)，直至獲得單一菌落，保存于-80℃冰箱中。
初篩。將上述純化保藏的菌株挑取一環(huán)至MRS液體培養(yǎng)基中活化，將牛津杯放置于脫脂乳固體培養(yǎng)基上，取200μL發(fā)酵液注入孔中，37℃培養(yǎng)72 h，觀察透明圈直徑，挑選直徑較大的菌株，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。
復(fù)篩。采用OPA測(cè)水解度方法進(jìn)行蛋白酶活力分析。將試驗(yàn)篩得乳桿菌接種至12%滅菌脫脂乳（115℃，15 min）中，選擇凝乳結(jié)實(shí)的菌株，測(cè)定這些菌株蛋白水解度。取5 mL發(fā)酵乳樣品，加入10 mL 0.75 mol/L三氯乙酸和1 mL蒸餾水后靜置10 min。在4℃，6 000g離心10 min，濾膜過濾。取400μL濾液，加入3 mL OPA。室溫反應(yīng)2 min后，于340 nm處測(cè)定吸光度。用0~10 mmol/L的L-絲氨酸制作標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算。
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