2.3噬菌體的系統(tǒng)進化地位分析
將Yen-yong1基因組序列上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫，使用BLASTn(默認參數(shù)，2024年9月29日)進行比對。結(jié)果顯示，與Yen-yong1同源性最高的前39個序列(top hits)均為細菌菌株，提示該噬菌體的祖先與細菌間存在大量基因交換。其中，與小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌Y201株(GenBank登錄號為CP124238.1)的基因組間的覆蓋率和相似度最高(E-value：0.0；percent identity：79.76%；query coverage：35%)。在BLASTn比對中，與Yen-yong1同源性最高的病毒是克雷伯菌噬菌體P85_2(GenBank登錄號為OR256025.1)，二者間的相似度為97%(36/37)，但相似區(qū)域僅占0.07%(query coverage)。BLASTn初步揭示Yen-yong1的基因組非常新穎，與公共數(shù)據(jù)庫中已公布的病毒間差異較大。
在基于全基因組比對構(gòu)建的蛋白譜進化樹(圖3)中，與Yen-yong1進化距離最近的是埃希氏菌噬菌體HK639、坂崎腸桿菌噬菌體phiES15和氣單胞菌噬菌體pAEv1818，它們聚成一個支簇(clade)，但Yen-yong1與它們之間的進化距離較遠(>0.4)。Yen-yong1與Escherichia phage HK639基因組間的比較圖(圖4A)也顯示其同源性較低。
▲圖3 Yersinia phage Yen-yong1的基于全基因組的蛋白進化譜樹
▲圖4 Yersinia phage Yen-yong1與Escherichia phage HK639的基因組比較(A)和近源噬菌體的VirClust分析結(jié)果圖(B)
為了進一步闡明Yen-yong1的進化地位，分別計算了Yen-yong1與這3株親緣關(guān)系最近的噬菌體間的平均核苷酸一致性(ANI)和DNA分子原位雜交值(isDDH)(表1)，這些值均小于種內(nèi)閾值(ANI≥95%，isDDH≥70%)，結(jié)果表明Yen-yong1是一個新的種。
▼表1 Yersinia phage Yen-yong1與3株近緣噬菌體之間的ANI、isDDH、PASC和VIRIDIC值
PASC和VIRIDIC分析平臺是ICTV推薦用于比對病毒間成對核苷酸序列相似度和成對基因組間相似性的工具。通過PASC對數(shù)據(jù)庫中所有病毒進行掃描比對，結(jié)果顯示Yen-yong1與其分享的最高PASC值僅為20.64%，最高VIRIDIC值僅為7.30%(表1)，二者均低于ICTV界定屬的閾值(≥70.00%)，結(jié)果表明Yen-yong1代表一個新的未知屬。
將Yen-yong1及在系統(tǒng)進化樹(圖3)中與其聚成一個支簇(clade)的3個近源噬菌體(HK639、phiES15和pAEv1818)上傳至VirClust平臺，分析其共享的核心基因。結(jié)果顯示，Yen-yong1與HK639、pAEv1818和phiES15間共享57個核心基因(圖4B)，占它們?nèi)縊RFs的20.00%。ICTV關(guān)于科和亞科的界定標準為：同一個科的所有病毒至少共享17.00%的核心基因；同一個亞科的所有病毒間共享基因占比為27.00%-79.00%。基于此，Yen-yong1與這3個噬菌體可以歸為同一個亞科。它們在蛋白譜系統(tǒng)進化樹中與有尾綱Caudoviricetes下Drexlerviridae科的2個噬菌體(Rtpvirus Rtp和Rogunavirus Jk06)共同構(gòu)成一個更大的支簇，這6個病毒間共享的核心基因占比為14.09%，低于科閾值(17.00%)。此前，HK639和phiES15在國際病毒分類系統(tǒng)中尚未確定分類地位。本研究表明，Yen-yong1與它們共同構(gòu)建的亞科實際上屬于一個以往未知的科。
2.4噬菌體的一步生長曲線
當MOI為1時，噬菌體-菌裂解液中的噬菌體滴度最高，為1.10×1010 PFU/mL(圖5A)，因此設(shè)定Yen-yong1的最佳MOI為1。以MOI=1繪制的一步生長曲線如圖5B所示。Yen-yong1的滴度在感染后即開始增加，但在10-30 min內(nèi)增量較小，在30-90 min急劇增加，并在90 min達到最高值，此后保持相對穩(wěn)定。結(jié)果表明，Yen-yong1的潛伏期為0-30 min，暴發(fā)期為30-90 min，暴發(fā)量為406.17 PFU/cell。
▲圖5 Yersinia phage Yen-yong1的最佳MOI(A)和一步生長曲線(B)
2.5 pH、鹽度、溫度敏感性和長期儲存與凍融實驗
噬菌體的理化穩(wěn)定性(pH、鹽度、溫度)是影響其應(yīng)用潛力的重要因素。Yen-yong1具有寬泛的pH耐受范圍(pH 2.0-13.0)，在pH 2.0-11.0時活性較穩(wěn)定(滴度>109 PFU/mL)，在pH 12.0和pH 13.0時活性下降，但仍具有溶菌活性(分別為3.09×108 PFU/mL和2.19×105 PFU/mL)(圖6A)。Yen-yong1在0、1%和3%鹽濃度下均保持高溶菌活性，滴度分別為6.76×108、4.47×108和4.17×108 PFU/mL(圖6B)。由于CICC 10869在5%、7%和9%鹽濃度的平板上無法生長成可見菌苔，因此無法形成可見噬菌斑。
▲圖6 Yersinia phage Yen-yong1的理化耐受性和長期儲存與凍融結(jié)果
在溫度耐受實驗中，Yen-yong1在-80-40℃的溫度范圍內(nèi)處理120 min后，保持穩(wěn)定高效的溶菌活性(滴度>109 PFU/mL)(圖6C)；在50-60℃處理120 min后滴度有所下降，但仍分別保留了2.14×107 PFU/mL和1.38×104 PFU/mL的滴度；在70℃及以上時，噬菌體滴度在30 min內(nèi)降至0，呈失活狀態(tài)(圖6C)。
在長期儲存與凍融實驗中，Yen-yong1在-80℃和-20℃下長期保存以及在-20℃反復(fù)凍融后，保持穩(wěn)定高效的溶菌活性(滴度>109 PFU/mL)。在-80℃下長期儲存并反復(fù)凍融后，雖然滴度有所下降，但在經(jīng)歷13次凍融和360 d的儲存后仍高達7.41×108 PFU/mL；在4℃保存360 d后，Yen-yong1噬菌體滴度高達2.46×108 PFU/mL；而在25℃保存330 d后，噬菌體滴度低于檢測限，呈失活狀態(tài)(圖6D)。結(jié)果顯示，將Yen-yong1凍存于-20℃和-80℃均為合適的保存方法，其中在-80℃宜分裝后凍存，以減少凍融損傷，而在-20℃下則可反復(fù)凍融。
2.6噬菌體對細菌生物被膜的清除作用
采用結(jié)晶紫染色法檢測了CICC 10869、CICC 21669和CMCC 52202的生物被膜形成能力及噬菌體清除細菌生物被膜的效果，結(jié)果如圖7所示。小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌CICC 10869、CICC 21669和CMCC 52202形成生物被膜的能力均為中等(ODt分別為2.69×ODc、2.70×ODc和2.66×ODc)。噬菌體Yen-yong1對CICC 10869、CICC 21669和CMCC 52202的生物被膜均具有顯著的清除作用(P<0.05)。
▲圖7小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌形成生物被膜的能力及Yersinia phage Yen-yong1對細菌生物被膜的清除能力
2.7噬菌體對生豬肉中病原菌的控制
為模擬豬肉短時擺案銷售的污染控制，在25℃將Yen-yong1應(yīng)用于污染了CICC 10869、CICC 21669和CMCC 52202的生豬肉片上，以評估其在室溫條件下對生豬肉片中小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的清除效果。如圖8A和表2所示，Yen-yong1對生豬肉片中小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的清除效果顯著，且隨著感染復(fù)數(shù)MOI的提高而增強。在MOI=1、10、100時，3 h內(nèi)Yen-yong1對CICC 10869的細菌清除率分別為32.20%、92.50%和93.48%。如圖8C、8D所示，在MOI=100時，3 h內(nèi)Yen-yong1對CICC 21669和CMCC 52202的清除率分別為52.77%和43.24%。
▲圖8 Yersinia phage Yen-yong1在25℃與4℃對生豬肉片中小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的清除率
▼表2 Yersinia phage Yen-yong1對生豬肉片抑菌實驗的結(jié)果
為模擬豬肉片貯運條件下的污染控制，在4℃將Yen-yong1應(yīng)用于污染了CICC 10869、CICC 21669和CMCC 52202的生豬肉片上，以評估其在冷藏條件下對生豬肉片中小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的清除效果。如圖8B和表2所示，在MOI=1、10、100時，噬菌體處理24 h后，所有實驗組的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌濃度均明顯低于對照組。Yen-yong1對生豬肉片中的CICC 10869的細菌清除率分別為91.21%、93.95%和98.28%，高于室溫下的清除率。如圖8C、8D所示，在MOI=100時，Yen-yong1對生豬肉片中的CICC 21669和CMCC 52202的細菌清除率分別為78.35%和96.33%，高于室溫下的清除率。
綜上所述，Yen-yong1對生豬肉中污染的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌具有優(yōu)良的除菌控菌效果，且在冷藏條件下效果更佳。
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