1 材料與方法
1.1 菌株及培養(yǎng)條件
豬源巴氏鏈球菌WUSP067由本課題組保存，分離自患腦膜炎的斷奶仔豬腦部。巴氏鏈球菌在THB(Todd-Hewitt Broth)液體培養(yǎng)基或THB固體培養(yǎng)基中于37 ℃培養(yǎng)箱(5% CO2)或搖床(180 r·min-1)中培養(yǎng)，需要時(shí)添加終濃度為100 μg·mL-1的壯觀霉素(spectinomycin，Spc); 測(cè)定細(xì)菌對(duì)糖的利用時(shí)用無(wú)糖的DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium)培養(yǎng)基，需要時(shí)加入10 g·L-1的葡萄糖(glucose，Glu)或10 g·L-1纖維二糖(cellobiose，Cel)。
1.2 主要試劑和試驗(yàn)動(dòng)物
THB培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博生物公司; 綿羊血購(gòu)自北京鼎國(guó)生物科技有限公司; DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司; 2× Rapid Taq Master Mix、2× Phanta Flash Master Mix、Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(HiScript Ⅱ QRT SuperMix)、膠回收試劑盒(FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit)購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司; SPF級(jí)ICR仔鼠(18日齡)購(gòu)自斯貝福生物技術(shù)有限公司。
1.3 生物信息學(xué)分析
利用NCBI網(wǎng)站中tBLASTn方法，以肺炎鏈球菌(NZ_AKBW01000001.1)為參照，分析纖維二糖利用基因簇CN52_RS0111090—CN52_RS0111095和CN52_RS0100970—CN52_RS0101000中各個(gè)基因編碼氨基酸序列與WUSP067的同源性，評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)為覆蓋率超過(guò)70%，氨基酸同源性超過(guò)30%。比對(duì)結(jié)果利用Chiplot網(wǎng)站繪圖。
1.4 RT-PCR測(cè)定基因共轉(zhuǎn)錄
利用Oligo軟件設(shè)計(jì)引物，由南京擎科生物科技有限公司合成，引物信息見表1。引物1-1-F/R、1-2-F/R、1-3-F/R、1-4-F/R分別用于確定E8M05_RS06225—E8M05_RS06230、E8M05_RS06235—E8M05_RS06250、E8M05_RS06250—E8M05_RS06255是否在同一個(gè)轉(zhuǎn)錄本上; 引物1-5-F/R、1-6-F/R、1-7-F/R、1-8-F/R分別用于確定E8M05_RS011050—E8M05_RS06265、E8M05_RS06265—E8M05_RS06270是否在同一個(gè)轉(zhuǎn)錄本上。挑取WUSP067單菌落于THB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)至D600值為0.6，提取細(xì)菌總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄500 ng RNA成cDNA。用上述引物檢測(cè)反轉(zhuǎn)錄生成的cDNA，以提取的RNA為陰性對(duì)照。RT-PCR反應(yīng)體系:2× Rapid Taq Master Mix 12.5 μL，10 μmol·L-1上、下游引物各1.0 μL，ddH2O 9.5 μL，模板1.0 μL。反應(yīng)條件:95 ℃ 3 min; 95 ℃ 15 s，50 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán); 72 ℃ 5 min。反應(yīng)結(jié)束后用10 g·L-1瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，通過(guò)凝膠成像儀觀察擴(kuò)增產(chǎn)物大小。
表1 引物序列
1.5 RT-qPCR檢測(cè)纖維二糖基因簇相關(guān)基因表達(dá)水平
1.5.1 引物設(shè)計(jì)
利用網(wǎng)站Integrated DNA Technologies設(shè)計(jì)檢測(cè)巴氏鏈球菌WUSP067纖維二糖基因簇的RT-qPCR的引物，由南京擎科生物有限公司合成，引物信息見表1。
1.5.2 樣品制備
挑取WUSP067單菌落接種于THB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r·min-1下培養(yǎng)至D600值為0.6; 4 ℃、5 000 r·min-1 離心5 min，棄上清液，PBS清洗1次。分別用含10 g·L-1Glu和10 g·L-1 Cel的DMEM培養(yǎng)基重懸至D600值為0.6，37 ℃、180 r·min-1 培養(yǎng)2 h。提取細(xì)菌總RNA，再用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，將所得的cDNA稀釋10倍，于-20 ℃保存。每個(gè)處理組3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。
1.5.3 RT-qPCR
以稀釋后的cDNA為模板，使用表1中的引物進(jìn)行RT-qPCR。反應(yīng)體系:2 × Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix 10.0 μL，10 μmol·L-1上、下游引物各0.4 μL，ddH2O 8.2 μL，模板1.0 μL。陰性對(duì)照為ddH2O，內(nèi)參基因?yàn)間yrA。RT-qPCR反應(yīng)條件:95 ℃ 30 s; 95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán); 95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。采用2-ΔΔCt方法分析基因的相對(duì)表達(dá)水平。
1.6 缺失株ΔcelAwp的構(gòu)建
巴氏鏈球菌缺失株的構(gòu)建參照文獻(xiàn)，引物由南京擎科生物有限公司合成，引物信息見表1。篩選壯觀霉素耐受基因，構(gòu)建有痕缺失株。以WUSP067基因組為模板，以引物CelA-A/B分別擴(kuò)增待缺失基因的上游臂celA-AB。以引物CelA-C/D分別擴(kuò)增待缺失基因的下游臂celA-CD，以Spc-F/R為引物擴(kuò)增spc片段。以上、下游同源臂AB、CD和spc為模板，以CelA-F/R為引物進(jìn)行融合PCR。反應(yīng)條件:95 ℃ 5 min; 95 ℃ 15 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，30個(gè)循環(huán); 72 ℃ 10 min。經(jīng)PCR得到的3段融合產(chǎn)物，通過(guò) 10 g·L-1 瓊脂糖凝膠電泳分離，切膠后用DNA片段回收試劑盒回收celA-AB-spc-CD片段。挑取WUSP067單菌落于37 ℃、180 r·min-1 搖床中培養(yǎng)至細(xì)菌生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，以1:100(體積比)轉(zhuǎn)接5 mL THB液體培養(yǎng)基中至D600值為0.02～0.07(約40 min)。取100 μL菌液，加入5 μL信號(hào)肽(IVLTGWWGV，250 μmol·L-1)，加入1.0 μg 融合片段celA-AB-spc-CD，于37 ℃下靜置培養(yǎng)2 h后涂布TS平板(含100 μg·mL-1 spc的THB固體培養(yǎng)基)。次日挑取單菌落，用引物CelA-X/Y和CelA-M/N分別鑒定有痕缺失株ΔcelA。以鑒定結(jié)果為陽(yáng)性的菌液為模板，使用引物CelA-A/D擴(kuò)增片段，送生物公司測(cè)序并分析測(cè)序結(jié)果。
1.7 WUSP067和ΔcelAwp菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定
1.7.1 在THB培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)曲線
挑取巴氏鏈球菌WUSP067和缺失株ΔcelAwp單菌落于37 ℃、180 r·min-1 下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，以1:100(體積比)轉(zhuǎn)接至10 mL THB液體培養(yǎng)基(50 mL錐形瓶)。每隔1 h 測(cè)量D600值。每個(gè)菌株3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，分別繪制各菌株生長(zhǎng)曲線。
1.7.2 在添加10 g·L-1Glu或10 g·L-1 Cel的DMEM培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)曲線
挑取WUSP067和缺失株ΔcelAwp單菌落于37 ℃、180 r·min-1搖床中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，5 000 r·min-1離心5 min，棄培養(yǎng)基，PBS清洗 1次，用等量的DMEM重懸后以1:100(體積比)轉(zhuǎn)接5 mL DMEM+10 g·L-1 Glu或10 g·L-1Cel(纖維二糖)液體培養(yǎng)基中(10 mL EP管)，37 ℃、180 r·min-1搖床中培養(yǎng)，每隔2 h測(cè)量D600值。每個(gè)菌株3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，分別繪制各菌株生長(zhǎng)曲線。
1.8 小鼠毒力試驗(yàn)
采用18日齡ICR級(jí)SPF仔鼠，在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)SYXK(蘇)2021-0086]開展毒力試驗(yàn)。每個(gè)試驗(yàn)組10只小鼠。正式攻毒前先復(fù)壯菌株:挑取WUSP067野生株與缺失株ΔcelAwp單菌落接種于THB液體培養(yǎng)基中; 37 ℃、180 r·min-1 培養(yǎng)至D600值約為0.8，4 ℃、5 000 r·min-1 離心5 min，棄上清液，PBS清洗1次，用200 μL PBS重懸，腹腔注射小鼠1只，菌量為3 ×108 CFU。10 h后脫頸處死小鼠，心臟取血，取少量血液劃線THB固體培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)10 h。挑取單菌落，接種培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，經(jīng)PCR鑒定為目的菌株。將鑒定正確的WUSP067野生株與缺失株ΔcelAwp轉(zhuǎn)接THB液體培養(yǎng)基，37 ℃、180 r·min-1 培養(yǎng)至D600值約為0.6，取9 mL菌液，4 ℃、5 000 r·min-1 離心5 min，用PBS清洗1次，使用3 mL PBS重懸后采用腹腔注射的方式攻毒，每只小鼠注射200 μL，攻毒菌量3×108 CFU，以注射PBS組作為陰性對(duì)照。攻毒后每天觀察并記錄小鼠死亡情況，共觀察14 d，繪制存活曲線。
1.9 數(shù)據(jù)處理與分析
RT-qPCR和生長(zhǎng)曲線測(cè)定的數(shù)據(jù)用非配對(duì)t檢驗(yàn)分析其差異顯著性; 小鼠毒力試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用 log-rank檢驗(yàn)來(lái)分析數(shù)據(jù)差異顯著性。
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