摘要：從湖南農藥廠甲胺磷廢水和污泥中分離到光合細菌菌株18株，經過初步篩選得到1株可降解甲胺磷[hethamidophos]的菌株HP-1，紅色圓形菌落，邊緣整齊光滑，中間稍稍突起，菌落直徑0.64~2.60mm，菌革蘭氏染色陰性G-，細菌單個細胞短桿形或彎曲桿形，0.40~0.70μm×1.2~2.0μm,不對稱出芽分裂，細胞具有極生鞭毛或亞極生鞭毛，片層狀光合內膜位于細胞膜下并與之平行，初步鑒定為沼澤紅假單胞菌[Rhodopesudomonas plaustris]。培養(yǎng)7d后，能夠降解甲胺磷[65.20%（500 mg/L）和49.60%（1 000 mg/L）]，且在外加碳源時能提高其降解性能，還能降解樂果、毒死蜱蜱、三唑磷和辛硫磷。該菌株發(fā)酵液能夠促進蘿卜種子萌發(fā)，提前發(fā)芽時間，具有促生生物學活性。
農藥生物修復是利用特定的生物[植物、微生物或原生動物]吸收、轉化、清除或降解農業(yè)生態(tài)環(huán)境中農藥污染，實現農業(yè)生態(tài)環(huán)境凈化，生態(tài)功能恢復的生物措施。在近60年的發(fā)展中，愈來愈受到研究者的重視。已有大量研究表明真菌、細菌、藻類等微生物對有機磷農藥甲胺磷、三唑磷、對硫磷、樂果、馬拉硫磷等有很好的降解作用[4-8,10,13,15,16,18-20]。但是，筆者未發(fā)現能夠降解甲胺磷農藥的光合細菌的分離和降解性能研究報道，可能是基于分離純化難和培養(yǎng)條件苛刻。同時已有報道認為光合細菌能夠促進作物生長，提高葉綠素含量，增強作物的抗逆性和提高作物產量，并能夠改善作物的品質。而其他非光合細菌的分離與降解性能的研究已有較多報道，但未見具有促生活性的報道。因此，基于這種想法，從生產甲胺磷農藥的廢水中篩選具有促生活性及可降解甲胺磷的光合細菌菌株，作為降解基因資源，為大規(guī)模生產有機磷農藥微生物降解菌菌劑和應用于農業(yè)生產提供實驗依據。
1材料與方法
1.1樣品來源
菌種分離自湖南農藥廠廢水和污泥。甲胺磷原藥[70%]、毒死蜱蜱原藥[67%]、三唑磷原藥[8%]和辛硫磷原藥[60%]均由湖南農藥廠提供；20%樂果乳油由湖南海利化工有限公司生產并提供。
1.2菌株分離、篩選與鑒定
將樣品混勻，分別取5g污泥和2mL廢水，置于裝有125mL PSB液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，加入濃度為200mg/L甲胺磷，室溫下25W白熾燈，距離培養(yǎng)瓶的距離25~40cm，培養(yǎng)10d，可以觀察到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基變紅棕色，其間每天手動搖勻3次。取出培養(yǎng)液1mL，再次置于含有125mL培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，加入濃度為400mg/L甲胺磷，同樣條件下培養(yǎng)5~7d。依照前面的方法，連續(xù)培養(yǎng)5~7次，甲胺磷的濃度也漸漸提高到3200~6400mg/L。利用雙層平板夾心法[參照孫德軍等[3]的方法并加以改進]，在直徑6 cm的培養(yǎng)皿中加入含有甲胺磷800mg/L PSB固體培養(yǎng)基，分別取10μL菌液均勻涂抹其表面，稍微干水汽后再加入同樣濃度的培養(yǎng)基，用封口膜封好，置于同樣的條件下培養(yǎng)7~10d，用牙簽挑出單菌落在PSB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，用同樣的方法純化3次，獲得純培養(yǎng)保存，編號HP-1。菌種的鑒定方法參照劉勇等[2]的方法。
1.3培養(yǎng)基
PSB液體培養(yǎng)基的制備，具體參照文獻[2]的方法。PSB固體培養(yǎng)基，在PSB液體培養(yǎng)基中加入18g和14g瓊脂。所有培養(yǎng)基的pH值為6.8左右，110℃滅菌20 min。
1.4菌株HP-1菌落形態(tài)和菌體形態(tài)觀察
以雙層平板夾心平板上生長的菌落形態(tài)描述菌落顏色、大小和形狀。革蘭氏染色參照參考文獻[2]。用電子顯微鏡觀察菌體大小、細菌鞭毛、繁殖方式和光合內膜系統(tǒng)。
1.5菌株HP-1活細胞色素吸收光譜的測定
取純培養(yǎng)液4mL，以空白培養(yǎng)基作為對照，用TU-1901雙光束分光光度計[北京普析儀器公司]進行波長掃描，波長范圍為190~900nm。
1.6菌株HP-1生長曲線的測定
在裝有125mL PSB液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，加入1mL菌液，分別加入62.5、125、250、500、1000、2000、4000 mg/L的甲胺磷，在與前述相同的培養(yǎng)條件下，第4d開始每天取樣測定OD660值，并繪制生長曲線。
1.7菌株HP-1生理生化特性的測定
細菌生理生化特性的測定具體參照文獻[2]的方法進行。
1.8菌株HP-1對甲胺磷耐受能力的測定
分別制備甲胺磷含量為400、800、1600、3 200、6 400、12 800 mg/L PSB液體培養(yǎng)基，接種培養(yǎng)5~7d,觀察記錄其生長情況。
1.9菌株HP-1對甲胺磷的降解率的測定
以目標農藥甲胺磷[由湖南農藥廠提供]作為唯一的碳源，配制含有目標農藥的500mg/L和1 000mg/L PSB培養(yǎng)液，接種菌液1mL于125 mL的培養(yǎng)液中，同時設有不接種菌的兩種濃度的空白對照和只接種菌而不加農藥的對照，以消除水解和光解等因素引起目標農藥減少的影響，在與前述條件相同的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)7d，取樣用GC氣相色譜測定細菌對目標農藥的降解率。
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