摘要
本試驗(yàn)旨在篩選出具有高效氨氮轉(zhuǎn)化能力的酵母菌，研究其對(duì)不同環(huán)境條件下的抗逆性。在肉雞糞便樣品中篩選酵母菌，并通過分析篩選酵母菌的菌體生物量、蛋白質(zhì)含量、總蛋白質(zhì)得率、氨氮降解率和生長(zhǎng)曲線等指標(biāo)，得到一株具有高氨氮轉(zhuǎn)化能力的酵母菌，并對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定。對(duì)篩選菌株進(jìn)行抗逆性分析，并與常見的單細(xì)胞蛋白生產(chǎn)菌株進(jìn)行比較。結(jié)果表明:菌株Y-7在篩選培養(yǎng)基中的菌體生物量為4.92 g/L，總蛋白質(zhì)得率為1.76 g/L，氨氮降解率為97.63%，均顯著高于其余6株菌(P<0.05)。通過比較7株疑似酵母菌的生長(zhǎng)曲線，菌株Y-7的生長(zhǎng)速度最快，該菌株被鑒定為克魯斯假絲酵母(Candida krusei)。經(jīng)過抗逆性對(duì)比分析，菌株Y-7的耐高溫和耐高鹽能力強(qiáng)于釀酒酵母和產(chǎn)朊假絲酵母。綜上所述，本試驗(yàn)篩選出一株具有高氨氮利用能力、高生長(zhǎng)速率和高抗逆性的克魯斯假絲酵母，為單細(xì)胞菌體蛋白的應(yīng)用提供了新的方法。
在全球人口持續(xù)增長(zhǎng)的背景下，人們對(duì)食物的需求急劇增加，特別是蛋白質(zhì)來源的缺乏已經(jīng)成為困擾人類的問題。在此需求下，畜牧業(yè)得到快速發(fā)展，但環(huán)境污染和自然資源緊張的問題日益突顯。因此，尋找和開發(fā)對(duì)動(dòng)物飼養(yǎng)有益且對(duì)生態(tài)環(huán)境友好的替代蛋白質(zhì)具有重要的意義。單細(xì)胞蛋白(single cell protein，SCP)又稱微生物蛋白，是指從微生物細(xì)胞培養(yǎng)中分離出來的干燥的微生物死亡的細(xì)胞或純化蛋白。SCP被認(rèn)為是一種重要的蛋白質(zhì)資源。SCP不僅富含蛋白質(zhì)，還含有碳水化合物、脂質(zhì)、礦物質(zhì)、核酸和維生素。特別是SCP含有高水平的必需氨基酸，如蛋氨酸和賴氨酸，使其在營(yíng)養(yǎng)上比傳統(tǒng)蛋白質(zhì)來源更有應(yīng)用前途。此外，SCP的生產(chǎn)原料來源廣泛、培育周期短、收獲率高，且不受季節(jié)、氣候和土壤等環(huán)境條件影響。
酵母菌、細(xì)菌、霉菌和藻類等微生物可以生產(chǎn)大量的SCP，其中酵母菌細(xì)胞較大、生長(zhǎng)迅速，對(duì)酸、高鹽和高濃度底物具有高抗逆性，是市場(chǎng)上廣泛認(rèn)可并普遍使用的生產(chǎn)SCP的菌株。酵母菌具備將無機(jī)氮源轉(zhuǎn)化為有機(jī)氮化合物的生物合成能力，但酵母菌對(duì)不同來源的無機(jī)氮源呈現(xiàn)在出等級(jí)偏好。酵母菌可以使用銨離子作為氮的唯一來源，因?yàn)樗鼈儞碛芯幋a所有氨基酸生物合成酶的基因。在酵母SCP生產(chǎn)過程中，菌株對(duì)無機(jī)氮源的利用效率及其生長(zhǎng)速率是決定SCP生產(chǎn)成本的關(guān)鍵因素。因此，篩選具有高氨氮利用效率和快速生長(zhǎng)特性的菌株，對(duì)降低酵母SCP生產(chǎn)成本具有重要意義。此外，在發(fā)酵過程中，酵母細(xì)胞不可避免受到多種相互關(guān)聯(lián)的應(yīng)激刺激，如高滲透壓、高溫、高酸、高濃度乙醇和饑餓等，這些應(yīng)激條件會(huì)顯著影響酵母菌群的工業(yè)發(fā)酵效率。因此，本研究擬從雞糞中篩選出氨氮利用能力強(qiáng)、蛋白質(zhì)含量高、生長(zhǎng)速度快且具有高抗逆性的菌株，以期為SCP的生產(chǎn)應(yīng)用提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)參考。
1材料與方法
1.1試驗(yàn)材料
1.1.1樣品
舍飼基礎(chǔ)飼糧的肉雞糞便采集于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京昌平南口中試基地肉雞舍。
1.1.2菌株
福邦釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Ⅰ型購(gòu)自安琪酵母股份有限公司。產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)CICC 1769購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection，CICC)。
1.1.3主要試劑及儀器
主要試劑:無水葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂粉、氯霉素均為生化試劑，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;(NH4)2SO4、NaCl、MgSO4·7H2O、K2HPO4·3H2O、FeSO4·7H2O、ZnSO4、CaCl2、CoCl2·6H2O均為分析純，購(gòu)自上海麥克林生化科技股份有限公司;乙二胺四乙酸(EDTA)、MnCl2·4H2O、(NH4)6Mo7O24·4H2O、CuSO4·5H2O均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
主要儀器:電子天平(ME204型)和pH計(jì)(FiveEasy PlusTM型)，購(gòu)自瑞士Mettler Toledo公司;立式壓力滅菌器(LS-50HD型)，購(gòu)自江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司;全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀(Bioscreen C PRO型)，購(gòu)自芬蘭Oy Growth Curves Ab Ltd公司;生物顯微鏡(CX43型)，購(gòu)自日本Olympus公司;恒溫振蕩器(IS-RDS4型)，購(gòu)自廣州深華公司;超凈工作臺(tái)(YT-CJ-2D型)，購(gòu)自北京儀諾科興科技發(fā)展有限公司;高速冷凍離心機(jī)(HR20M型)，購(gòu)自湖南赫西儀器裝備有限公司;自動(dòng)微生物鑒定分析系統(tǒng)(GEN III MicroStation型)，購(gòu)自美國(guó)Biolog公司。
1.1.4培養(yǎng)基成分及配制
富集培養(yǎng)基:葡萄糖10.0 g，(NH4)2SO4 2.0 g，NaCl 1.0 g，MgSO4·7H2O 1.0 g，K2HPO4·2H2O 1.0 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.4 g，氯霉素0.1 g，微量元素溶液1.0 mL，蒸餾水1 L。115℃高壓滅菌30 min，pH 7.2~7.4。
篩選培養(yǎng)基:葡萄糖15.0 g，(NH4)2SO4 1.43 g，NaCl 1.0 g，K2HPO4·2H2O 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，微量元素溶液1.0 mL，蒸餾水1 000 mL。115℃高壓滅菌30 min，pH 7.2~7.4。
微量元素溶液:EDTA 10.0 g，ZnSO41.2 g，CaCl2 1.5 g，MnCl2·4H2O 1.0 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 2.0 g，(NH4)6Mo7O24·4H2O 1.0 g，CuSO4·5H2O 1.0 g，CoCl2·6H2O 1.0 g，水1 000 mL。pH 7.2~7.4。
YPD培養(yǎng)基:葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母浸粉10 g，水1 000 mL。固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上補(bǔ)加20 g瓊脂粉。115℃高壓滅菌30 min。
BUY培養(yǎng)基:BUY培養(yǎng)基60 g，水1 000 mL。121℃高壓滅菌20 min，pH 5.6。
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