微生物在生長繁殖過程中需要碳源、氮源、能源、生長因子、無機(jī)鹽、水分六大營養(yǎng)物質(zhì)，而無機(jī)鹽主要可為微生物提供除碳源、氮源以外的各種重要元素，在微生物發(fā)酵的作用是構(gòu)成菌體細(xì)胞成份，作為酶的組成部分、酶的激活劑或抑制劑，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的滲透壓、pH、氧化還原電位等，對發(fā)酵菌體的影響效果雖不及碳源和氮源，但適量的添加可促進(jìn)菌體健康快速的生長繁殖，提高其代謝產(chǎn)物量。磷常以磷酸鹽的形式加入到培養(yǎng)基中，據(jù)市場調(diào)研，在微生物發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)過程中，考慮到用量大，混合難度等問題，大部分微生物發(fā)酵廠家多使用食品級磷酸代替磷酸鹽。因此，磷酸也可為對微生物生長及發(fā)酵提供磷源。
《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB2760-2014）中食品工業(yè)用加工助劑使用中明確規(guī)定，磷酸可作為食品工業(yè)用加工助劑（發(fā)酵用營養(yǎng)物質(zhì)）在發(fā)酵工藝上使用。而根據(jù)生產(chǎn)方式的不同，市面上磷酸產(chǎn)品又分為熱法磷酸（Thermal method phosphoric acid,以下簡稱TPA）和濕法磷酸（Wet phosphoric acid，簡稱WPA）兩類。由于WPA雜質(zhì)較多需經(jīng)凈化處理后才能達(dá)到與熱法磷酸相同品質(zhì)，由此產(chǎn)生了濕法凈化磷酸產(chǎn)品（Purified Wet Phosphoric Acid,以下簡稱PPA）。為探究磷源對枯草芽孢桿菌生長及代謝的影響，本試驗(yàn)選取了以磷酸鹽形式添加的磷源、以濕法凈化磷酸形式添加的磷源、和以熱法磷酸形式添加的磷源，添加入枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基中進(jìn)行相關(guān)驗(yàn)證試驗(yàn)。
1實(shí)驗(yàn)部分
1.1原料及試劑
試驗(yàn)菌種：枯草芽孢桿菌（貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院菌種保存室提供）。
試劑：食品添加劑濕法磷酸（85%）、食品添加劑熱法磷酸（85%）、磷酸二氫鉀、酵母粉、蛋白胨、瓊脂、牛肉膏、氫氧化鈉，氫氧化鉀、碳酸鈣、酒石酸鉀鈉、結(jié)晶酚、亞硫酸鈉、可溶性淀粉、碘粒、碘化鉀等，以上試劑均為分析純。
培養(yǎng)基及試劑配制：《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程（第四版）》進(jìn)行配制。
LB基礎(chǔ)培養(yǎng)基（蛋白胨10g、酵母提取物5 g、葡萄糖5g、氯化鈉10g、瓊脂10g、碳酸鈣0.25g，加純水至1000mL，pH調(diào)節(jié)7.2～7.4（1mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)）121℃，高壓滅菌30min）。LB磷酸鹽培養(yǎng)基（在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加磷酸二氫鉀0.35g），LB磷酸培養(yǎng)基（在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加磷酸0.29g，氫氧化鉀0.15g)
淀粉培養(yǎng)基：可溶性淀粉2g、蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化鈉5g、瓊脂20g，加純水至1000 mL，調(diào)節(jié)pH至7.0（1mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)）121℃，高壓滅菌30min。
固體培養(yǎng)基配制：按照以上配方，每1000mL培養(yǎng)基中加入即可。
1.2主要儀器和設(shè)備
精密天平；立式壓力蒸汽滅菌鍋（BXM-30R）；恒溫振蕩培養(yǎng)箱(DHP-9052B)；超凈工作臺（帶紫外燈）；偏光顯微鏡；石墨加熱板（DBXAB）；紫外可見分光光度計(jì)（PE Lambda）等。
1.3實(shí)驗(yàn)方法
1.3.1枯草芽孢桿菌固體培養(yǎng)
用接種針挑取已活化好的枯草桿菌點(diǎn)接于LB基礎(chǔ)培養(yǎng)基、LB磷酸鹽培養(yǎng)基、LB熱法磷酸培養(yǎng)基、LB濕法磷酸培養(yǎng)基中間，倒置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后用游標(biāo)卡尺測量單菌落直徑大小。
1.3.2枯草芽孢桿菌液體培養(yǎng)
微生物類生長狀況可根據(jù)發(fā)酵液中細(xì)胞含量（通常采取比濁法進(jìn)行OD值檢測，OD值與細(xì)胞含量成正相關(guān)）進(jìn)行判斷。
1）取活化好的菌落斜面一支，以1mL0.9%生理鹽水沖洗菌苔，待完全沖洗干凈后，吸取1mL接種到250mL LB液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，置于37℃、120 r/min的恒溫培養(yǎng)振蕩器，培養(yǎng)24h即得酵母種子液。
2）各試驗(yàn)組的LB液體培養(yǎng)基配制好后按照試驗(yàn)要求分裝于500mL三角錐瓶中，每瓶250.00g，標(biāo)注后滅菌備用。
3）接種種子液。按接種量為4%接種于三角錐瓶中，置于37℃、120 r/min的恒溫培養(yǎng)振蕩器培養(yǎng)48h。
4）生長量測定。采用比濁法進(jìn)行測定。以未接種的LB液體培養(yǎng)基作為空白對照，在波長600 nm條件下，測定OD值。
1.3.3枯草芽孢桿菌產(chǎn)酶能力
枯草芽孢桿菌在代謝繁殖過程中能夠產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、葡聚糖酶、植酸酶、果膠酶、木聚糖酶等十幾種酶而具有很強(qiáng)的降解活性。本試驗(yàn)選取淀粉酶進(jìn)行檢測，以透明圈直徑大小做為檢測指標(biāo)，用以驗(yàn)證不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌在產(chǎn)蛋白酶能力上是否存在影響。將試驗(yàn)1.3.1中在四種固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)出的菌落使用接種針點(diǎn)接于淀粉培養(yǎng)基上，倒置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。通過淀粉培養(yǎng)基觀察產(chǎn)淀粉酶的能力，該培養(yǎng)基一般無色透明，滴加盧哥氏碘液，輕搖平皿，使碘液鋪滿培養(yǎng)基表面，等待片刻，培養(yǎng)基中未被降解的淀粉酶遇碘變藍(lán)，菌落周圍淀粉被降解的地方出現(xiàn)透明圈，最后采用游標(biāo)卡尺測量菌落及透明圈直徑大小。
1.3.4數(shù)據(jù)處理方法
采用SPSS17.0軟件中對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，多重比較（LSD）確定組間差異，結(jié)果以“均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，標(biāo)注相同字母（P＞0.05）表示無差異，標(biāo)注不同字母（P<0.05）表示存在差異，EXCEL軟件作表。
2結(jié)果與分析
2.1枯草芽孢桿菌固體、液體培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果
枯草芽孢桿菌固體、液體培養(yǎng)見圖1所示。
不同培養(yǎng)基中枯草芽孢桿菌培養(yǎng)結(jié)果見表1。
圖1枯草芽孢桿菌固體、液體培養(yǎng)示意圖
表1不同培養(yǎng)基中枯草芽孢桿菌固體、液體培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果
由表1可知，枯草芽孢桿菌培養(yǎng)48h后，不添加磷源、添加磷酸鹽、添加TPA、添加PPA的培養(yǎng)基中枯草芽孢桿菌直徑分別為7.579mm、10.021mm、11.051mm、11.363mm，比不添加磷源的分別增大2.244mm、3.472mm、3.784mm;發(fā)酵液中OD值分別為2.452、2.561、2.563、2.556，比不添加磷源的分別增加0.141、0.111、0.104。
2.2枯草芽孢桿菌產(chǎn)酶能力
圖2枯草芽孢桿菌產(chǎn)酶能力
表2枯草芽孢桿菌產(chǎn)淀粉酶結(jié)果
由圖2、表2可知，從1#、2#、3#、4#固體培養(yǎng)基中挑取的枯草芽孢桿菌在淀粉培養(yǎng)基上的透明圈直徑、產(chǎn)淀粉酶菌落直徑、產(chǎn)淀粉酶透明圈直徑/菌落直徑值上不存在顯著性差異，由此說明培養(yǎng)基中添加適量磷酸鹽、TPA和PPA對枯草芽孢產(chǎn)淀粉酶能力不會產(chǎn)生抑制。
3結(jié)語
通過在枯草芽孢培養(yǎng)基中不添加磷源、以磷酸鹽形式添加磷源、以TPA形式添加磷源、以PPA形式添加磷源，培養(yǎng)48h后各指標(biāo)變化來判斷磷源對枯草芽孢桿菌生長的影響。由試驗(yàn)數(shù)據(jù)可知添加磷源，可促進(jìn)枯草芽孢生長；而以磷酸鹽形式和以TPA、PPA形式添加磷源，都能夠?yàn)榭莶菅挎邨U菌的生長提供磷源，且促進(jìn)效果一致。
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