摘要:試驗旨在篩選優(yōu)質(zhì)土壤源益生菌菌種資源，為畜牧生產(chǎn)中微生態(tài)制劑研發(fā)提供候選菌株。試驗以北京市郊區(qū)農(nóng)田土壤為材料，經(jīng)紫外誘變、革蘭氏染色和接觸酶試驗分離并篩選出1株對金黃色葡萄球菌具有明顯抑制能力的菌株。通過16S rRNA基因進化分析和種屬鑒定，判定該菌為一株地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)。進一步通過耐熱、耐酸、耐膽鹽和抗生素敏感性檢測，發(fā)現(xiàn)該地衣芽孢桿菌在85℃處理10 min后存活率高達93.33%，pH為3.0及2.5時對其活性均影響較小，并且在0.3%、1.0%和2.0%的膽鹽濃度下培養(yǎng)3h仍可繼續(xù)生長，表現(xiàn)出優(yōu)良的抗逆性。通過與病原菌混合培養(yǎng)以及對多種致病菌的抑菌試驗檢測，發(fā)現(xiàn)該菌株對多種革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都具有抑制作用。


我國是豬的養(yǎng)殖和消費大國，豬肉是人民肉類膳食結(jié)構(gòu)的重要組成部分。據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部數(shù)據(jù)顯示，在經(jīng)歷了非洲豬瘟及新型冠狀病毒肺炎疫情的考驗后，2020年全國生豬生產(chǎn)基本恢復，規(guī)?；蔬_到57%。然而，隨著養(yǎng)殖規(guī)?；s化水平不斷提升，動物與自然環(huán)境(土壤等)的接觸受到極大限制，導致動物正常消化道微生物區(qū)系建立發(fā)生障礙。特別是在仔豬斷奶階段，在外界環(huán)境條件發(fā)生變化時，易引起動物消化道微生態(tài)失衡，從而降低了仔豬對病原菌的抵抗能力，引起動物機體細菌性腹瀉，影響生產(chǎn)性能。長期以來，抗生素在改善畜禽生長性能和疾病防治方面發(fā)揮重要作用，但養(yǎng)殖業(yè)濫用抗生素現(xiàn)象十分普遍，導致細菌耐藥性增強、耐藥菌株擴散和抗生素殘留等一系列問題，嚴重威脅養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展和人類健康。因此，開發(fā)新型抗生素替代品已是當前飼料添加劑領(lǐng)域的研究熱點。


芽孢桿菌有廣譜抑菌活性，能產(chǎn)生豐富的代謝活性物質(zhì)，具有良好的益生作用。耐高溫、耐酸，且方便保存，是當前應用廣泛的一種益生菌。地衣芽孢桿菌對病原微生物有抑制和拮抗作用，對體內(nèi)有益菌則有促生長作用，能夠調(diào)整與治療菌群失調(diào)，還可通過奪氧生物效應使腸道缺氧，利于大量有益健康的厭氧菌生長，通過此種雙重作用可以維持機體腸道微生態(tài)平衡，進而預防和治療腸道疾病。由于不同菌株間具有特性差異，且其生長特性、制備工藝、生物學活性以及在畜禽中的作用效果會因發(fā)酵原料及應用對象不同而產(chǎn)生很大差異。目前雖已有較多芽孢桿菌制劑應用于飼料中，但源于環(huán)境土壤的地衣芽孢桿菌益生菌菌株卻鮮見報道。因此，篩選出能明顯抑制常見致病菌且抗逆性強的芽孢桿菌具有較大的研究和開發(fā)前景。本研究以土壤為材料分離并篩選地衣芽孢桿菌，研究其生理生化特性和益生性能，為益生菌在畜禽中的應用提供菌種。


1材料與方法


糖20g，吐溫80 1 mL，磷酸氫二鉀2g，乙酸鈉5g，檸檬酸三氨2g，七水硫酸鎂0.2g，四水硫酸錳0.05g，酵母粉4g，用蒸餾水定容至1000mL。


MRS瓊脂培養(yǎng)基:1L MRS肉湯培養(yǎng)基中加瓊脂15 g。


麥康凱培養(yǎng)基:月示胨胨3g，豬膽鹽5g，中性紅0.025g，蛋白胨胨17g，乳糖10g，結(jié)晶紫0.001g，氯化鈉5g，瓊脂15g，用蒸餾水定容至1000mL。


M17培養(yǎng)基:大豆蛋白胨胨5.0 g，酵母提取物5.0 g，酪蛋白胨胨5g，抗壞血酸0.5g，牛肉浸膏2.5g，β-甘油磷酸二鈉19g，MgSO4·7H2O0.25g，瓊脂15g，用蒸餾水定容至1000mL。


糖醇發(fā)酵培養(yǎng)基:蛋白胨胨5g，牛肉粉5g，酵母膏5g，吐溫80 0.5 mL，糖或醇類10g，瓊脂5g，蒸餾水1 000mL，加上1.6%溴甲酚紫溶液1.4mL。


乳糖測定培養(yǎng)基:乳糖10g，酵母膏1g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL。


LB液體培養(yǎng)基:蛋白胨胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉5g，用蒸餾水定容至1000mL。


LB固體培養(yǎng)基:1L LB培養(yǎng)基中加瓊脂15g。


1.2菌株的分離與純化


取1g土樣放于裝有9mL無菌生理鹽水的試管中，漩渦器震蕩混勻。取稀釋液進行10倍遞增稀釋，然后選擇3個適宜梯度的稀釋液各1 mL涂布于含有10mg/kg放線菌酮的MRS瓊脂培養(yǎng)基及M17瓊脂培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)48~72h，觀察并記錄菌落形態(tài)。挑取長勢良好的特征單菌落于MRS液體培養(yǎng)基中，進行劃線分離純化。觀察肉湯是否變渾濁，有渾濁的放置4℃冰箱貯藏備用。


將長勢良好的特征單菌進行紫外誘變，涂布于LB平板上，每平皿控制菌落在30~50個，在37℃下恒溫培養(yǎng)。在剛產(chǎn)生針尖樣菌落時，用內(nèi)徑6mm的打孔器連同下方瓊脂一同取出，轉(zhuǎn)移至無菌空白平皿內(nèi)。在37℃下繼續(xù)培養(yǎng)24h后，涂布于有金黃色葡萄球菌的平皿上，篩選出抑制能力強的誘變菌株進行后續(xù)試驗。


相關(guān)新聞推薦

1、牛乳中細菌的檢查實驗——美藍還原試驗法

2、微生物共代謝類型具體表現(xiàn)及應用現(xiàn)狀

3、?海分枝桿菌感染患者集中在哪里？?海分枝桿菌毒性大嗎

4、不同溫度、ph、N源、C源下?氟磺胺草醚降解菌株FCX2生長特性

5、自然霉變玉米產(chǎn)生的霉菌毒素對肉鴨生產(chǎn)性能影響（上）