菌株分離鑒定：參考國(guó)標(biāo)GB 4789.30-2016方法進(jìn)行分離培養(yǎng)。樣品經(jīng)LB1增菌（30℃,22-26h），轉(zhuǎn)接LB2增菌（30℃,22-26h）。取增菌液劃線接種于PALCAM培養(yǎng)基和LM顯色培養(yǎng)基上（37℃,24-48h）。挑取可疑菌落接種TSB培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)后，提取DNA。以DNA為模板，先用李斯特菌屬通用引物Prs進(jìn)行PCR擴(kuò)增（預(yù)期片段370bp），再將PCR陽(yáng)性產(chǎn)物用LM特異性引物L(fēng)om2234進(jìn)行PCR擴(kuò)增（預(yù)期片段420bp），經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定確認(rèn)LM。ATCC19115作為陽(yáng)性對(duì)照，ddH2O作為陰性對(duì)照。引物序列詳見(jiàn)表2。

血清型鑒定：使用日本生物研究所的LM診斷血清試劑盒鑒定分離株血清型。O抗原鑒定：細(xì)菌懸液熱處理后與相應(yīng)血清在載玻片上反應(yīng)觀察凝集。H抗原鑒定：使用克雷基氏試管法篩選運(yùn)動(dòng)性強(qiáng)的菌株，其福爾馬林滅活液與相應(yīng)血清在試管中于51℃水浴1h后觀察凝集。根據(jù)陽(yáng)性結(jié)果判定血清型。


多位點(diǎn)序列分型（MLST）：根據(jù)巴斯德研究所網(wǎng)站（網(wǎng)址略）提供的7個(gè)管家基因（abcZ,bglA,cat,dapE,dat,ldh,lhkA）設(shè)計(jì)引物（引物序列詳見(jiàn)表3）。提取分離株DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在巴斯德研究所MLST數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)以確定菌株序列型（ST）和克隆群（CC）。

細(xì)菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定：從不同來(lái)源、血清型及ST型的LM分離株中選取25株，及參考株ATCC19115進(jìn)行測(cè)定。將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液OD600nm值調(diào)節(jié)為0.2，轉(zhuǎn)接于新鮮BHI培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)。從3h開(kāi)始每小時(shí)測(cè)定菌液OD600nm值，繪制生長(zhǎng)曲線。每組3個(gè)重復(fù)。


微孔板測(cè)定細(xì)菌生物被膜形成能力：選取25株LM分離株及參考株ATCC19115進(jìn)行測(cè)定。將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液濃度調(diào)節(jié)至OD600nm值為0.2，再稀釋100倍加入96孔細(xì)胞板（200μL/孔），每株菌6個(gè)重復(fù)，陰性對(duì)照為BHI培養(yǎng)基。37℃靜置培養(yǎng)48h。棄去培養(yǎng)物，PBS清洗3次去除浮游菌。200μL甲醇固定20min，干燥后200μL結(jié)晶紫染色10min，蒸餾水清洗干燥，200μL 90%酒精脫色10min，測(cè)定OD595nm值。


屠宰場(chǎng)消毒劑對(duì)分離菌株的最小抑菌濃度（MIC）測(cè)定：選取25株LM分離株及參考株ATCC19115進(jìn)行測(cè)定。將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液濃度調(diào)整至OD600nm值為1.0，再用BHI培養(yǎng)基稀釋1000倍備用。選用0.2%甲醛溶液、0.2%苯扎溴銨、0.5%碘溶液和2%氫氧化鈉4種消毒劑。將消毒劑在Eppendorf管中用蒸餾水連續(xù)2倍比稀釋。不同稀釋度的消毒劑（100μL/孔）與稀釋菌液（100μL/孔）加入96孔板混勻。37℃培養(yǎng)20-24h后測(cè)定OD600nm值。MIC定義為完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度。


結(jié)果


單增李斯特菌PCR鑒定：所有分離株均經(jīng)Prs引物擴(kuò)增得到約370bp片段（圖1A），Lom2234引物擴(kuò)增得到約420bp片段（圖1B），確認(rèn)為L(zhǎng)M。

菌株檢出情況：從1239份樣品中共分離出LM 58株，總檢出率為4.68%。地區(qū)分布：天水市檢出13株（9.85%），定西市檢出38株（8.90%），慶陽(yáng)市檢出6株（3.75%），甘南檢出1株（1.20%），白銀市和平?jīng)鍪形礄z出。動(dòng)物種類來(lái)源：豬樣品檢出26株（3.68%），牛樣品檢出12株（7.05%），羊樣品檢出9株（6.28%），雞樣品檢出8株（4.28%）。樣品類型來(lái)源：胴體樣品檢出14株（7.33%），器具環(huán)境樣品檢出40株（4.80%），污水樣品檢出4株（3.48%）。菌株編號(hào)依據(jù)來(lái)源地（定西：DX2023LM01-38；慶陽(yáng)：QY2023LM01-06；天水：TS2023LM01-13；甘南：GN2023LM01）。


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