2、結(jié)果與分析
2.1磷酸吡哆醛標準曲線
磷酸吡哆醛的標準曲線如圖1所示。該標準曲線的線性回歸方程為y=9.7651×10^6 x-632079，式中x代表磷酸吡哆醛的質(zhì)量濃度(g/L)，y代表磷酸吡哆醛的峰面積。該線性回歸方程的R2為0.99305，表明該標準曲線在0~3.0 g/L范圍呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。
2.2高產(chǎn)磷酸吡哆醛的乳酸菌的篩選
選取超低溫冰箱保藏的36株乳酸菌，通過高效液相色譜法測定其發(fā)酵液中磷酸吡哆醛的含量，結(jié)果如表1所示。表中不同小寫字母代表不同乳酸菌產(chǎn)磷酸吡哆醛的含量具有顯著性差異(P<0.05)。由表1可知，36株乳酸菌發(fā)酵液中磷酸吡哆醛的含量差異明顯，其中編號為N11的乳酸菌產(chǎn)磷酸吡哆醛的含量最高，為313.52 mg/L。因此，下一步選取該菌株研究其益生特性。
2.3菌株N11的生長曲線和產(chǎn)酸特性曲線
從圖2可以看出，菌株N11在0至6 h生長緩慢，OD600 nm值上升也比較慢，由此可知菌株在該段時間處于生長延遲期。在培養(yǎng)的6~18 h，該菌株急劇生長，生物量大幅度增加，MRS培養(yǎng)基中pH值急劇下降，由此可以判斷該菌株處于對數(shù)生長期。這個時期菌株活力明顯增強，產(chǎn)生大量乳酸及其它代謝產(chǎn)物。該菌株的光密度值在18 h后趨于穩(wěn)定，為0.606。培養(yǎng)液的pH值也逐漸平緩，判斷此時菌株處于生長穩(wěn)定期。
2.4菌株N11的最適生長溫度
圖3為菌株N11在不同溫度下的光密度值。由該圖可以看出，該菌株在25~40℃時生長良好。當(dāng)溫度超過60℃時，該菌株的生長停滯。在37℃時，該菌株生長活躍，菌體的光密度值最大，因此該菌株的最適生長溫度37℃。
2.5菌株N11的最適pH值
從圖4可以看出，菌株在pH 4.0~8.0范圍內(nèi)都可以生長。當(dāng)MRS培養(yǎng)基的初始pH值為6.0時，菌體的光密度值達到最大，此時菌株生長活躍，生物量最大，因此該菌株的最適生長pH值為6.0。
2.6菌株N11對過氧化氫的耐受能力
過氧化氫是一種相對較強的氧化劑，菌株對過氧化氫的耐受力是衡量其抗氧化能力的重要指標之一。從圖5可以看出，含不同濃度的過氧化氫的培養(yǎng)基對菌體的損傷程度不同，過氧化氫濃度越高，對菌株產(chǎn)生氧化損傷越強。當(dāng)過氧化氫濃度為0.5 mmol/L時，其對菌株N11的影響較弱。但隨著過氧化氫濃度的增加，菌體的光密度值逐漸下降。當(dāng)過氧化氫濃度為1.0 mmol/L，菌株生長較為良好，說明該菌株可以耐受過氧化氫濃度為1.0 mmol/L，該結(jié)果表明菌株N11在一定程度上可修復(fù)過氧化氫造成的氧化損傷。
2.7菌株N11的耐鹽能力
從圖6可以看出，當(dāng)氯化鈉的質(zhì)量分數(shù)小于4%時，菌株N11可以正常生長，其產(chǎn)酸和代謝功能幾乎未受影響。當(dāng)氯化鈉質(zhì)量分數(shù)超過4%時，該菌株的生長繁殖受到一定影響，產(chǎn)酸能力開始降低，培養(yǎng)液pH值急劇上升。當(dāng)氯化鈉質(zhì)量分數(shù)在10%左右時，菌體細胞所處環(huán)境滲透壓過高，細胞收縮，胞內(nèi)的水分大量流失，細胞內(nèi)部代謝產(chǎn)物的積累對細胞有毒害作用，最終致使菌體全部衰亡。醬油、泡菜等食物發(fā)酵要求菌株耐鹽能力要達到6%，菌株N11符合耐鹽能力的基本要求。
2.8菌株N11的低溫耐受能力
菌株在低溫的環(huán)境下生長會減慢一些代謝反應(yīng)的速率，進而導(dǎo)致細胞受損死亡。4℃低溫會使菌內(nèi)酶活會下降，菌株受到損傷，代謝產(chǎn)物改變。在-20℃的低溫條件下會有冰晶在細胞中形成，細胞膜會因為這些冰晶的作用而損傷，菌株的代謝隨之失去平衡，進而導(dǎo)致生長停止，所以通過測定菌株N11耐低溫能力來判斷其在應(yīng)用中的儲存期限，為后續(xù)產(chǎn)品的開發(fā)提供基礎(chǔ)。從圖7可以看出，菌株在-20℃貯存1~3 d，活菌數(shù)變化較小。貯存3 d后，菌株N11的活菌數(shù)有明顯的下降趨勢。儲存第10天，活菌數(shù)下降了5個數(shù)量級。當(dāng)每毫升儲存液中活菌數(shù)在10^6~10^7時，菌株才能更好的發(fā)揮益生作用。該菌株在-20℃下冷凍5 d，活菌數(shù)仍有10^6個。該結(jié)果表明篩選的菌株N11耐低溫能力良好，在一定時間內(nèi)能夠滿足其發(fā)揮益生作用的足夠的活菌數(shù)，為后續(xù)產(chǎn)品開發(fā)提供了良好的基礎(chǔ)。
2.9菌株N11的自凝集能力
菌株一般都會出現(xiàn)自凝集現(xiàn)象。自凝集性能夠使同一菌株間細胞黏附于腸道中，從而形成益生生物膜，有利于維持腸道菌群的平衡。自凝集性與黏附腸道的能力呈正相關(guān)性，菌株的自凝集率越高，越易和腸道黏附，從而實現(xiàn)對機體的保護。從圖8可以看出，隨著時間的延長，篩選的菌株N11的自凝集率逐漸升高。在24 h時，自凝集率達到了41.13%。對其自凝集能力的測定為微生態(tài)制劑的開發(fā)提供了重要基礎(chǔ)。
2.10菌株N11的耐酸能力
胃液中的pH值一般在2.0~3.0。胃液中較低的pH值是阻攔細菌進入腸道的天然屏障。食物停留消化在胃中的時間為2~4 h。乳酸菌發(fā)揮作用取決于其能否耐受低pH值，保持較高活菌數(shù)，順利通過胃酸環(huán)境，在腸道發(fā)揮生理功能。從圖9可以看出，當(dāng)pH為2.0時，活菌數(shù)隨著時間的延長逐漸下降。pH 3.0和pH 3.5的低酸性環(huán)境幾乎未對該菌生長造成影響，表明篩選的菌株N11具備一定的耐酸能力，但仍需進一步提升。
2.11菌株N11的耐膽鹽能力
乳酸菌需要通過在腸道內(nèi)定植，從而在人體內(nèi)發(fā)揮作用。因此其能否在腸道內(nèi)定植是至關(guān)重要的，而這與腸道內(nèi)膽鹽的濃度密切相關(guān)。從圖10可以看出，菌株N11在0.3%的膽鹽環(huán)境下，活菌數(shù)有較明顯的下降，細菌細胞膜受損，菌體死亡。在膽鹽濃度為0.03%環(huán)境下，菌株N11的活菌數(shù)較高。隨著時間進一步的延長，該菌的活菌數(shù)幾乎未受到膽鹽的影響。在膽鹽質(zhì)量分數(shù)為0.1%的環(huán)境下，菌株N11仍然可以保持較高的活菌數(shù)，表明篩選的菌株具有較好的耐膽鹽能力。
2.12菌株N11的抑菌能力
乳酸菌在代謝過程中可產(chǎn)生細菌素，也可代謝產(chǎn)生乳酸和其它有機酸，這些代謝物可阻礙病原菌在腸道內(nèi)的定植與生長。乳酸菌的抑菌特性是其適用于工業(yè)生產(chǎn)的一個重要指標。從圖11可以看出，篩選的乳酸菌菌株N11對5種指示菌熒光假單胞菌、大腸桿菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌有不同程度的抑菌效果。菌株N11對熒光假單胞菌有顯著的抑菌作用，抑菌圈的直徑大于15 mm，為18.75 mm。其余幾種指示菌的抑菌圈直徑分別是17.52，17.32，17.68 mm和18.20 mm，表明這些指示菌生長過程中受到菌株N11代謝產(chǎn)物的抑制。
注：菌株1：單增李斯特菌；菌株2：大腸桿菌；菌株3：熒光假單胞菌；菌株4：金黃色葡萄球菌；菌株5：沙門氏菌。圖中小寫字母表示顯著性差異(P<0.05)。
3、結(jié)論
本研究選取實驗室超低溫冰箱保藏的36株乳酸菌為研究對象，通過高效液相色譜法測定其發(fā)酵液中磷酸吡哆醛的含量，篩選出1株能夠高產(chǎn)磷酸吡哆醛的菌株N11，其產(chǎn)磷酸吡哆醛的產(chǎn)量高達313.52 mg/L。對菌株N11進行了一系列益生特性研究，結(jié)果表明該菌株在培養(yǎng)的6 h內(nèi)為生長延遲期，6 h后菌體密度急劇增加，進入對數(shù)生長期，培養(yǎng)18 h后菌株生長趨于穩(wěn)定，進入穩(wěn)定期。該菌株的最適生長溫度為37℃，最適pH值為6.0。菌株N11耐滲透壓的最高值為6%，在-20℃冷凍5 d，菌株仍具備可以發(fā)揮益生作用的活菌數(shù)。菌株24 h自凝率為41.13%，且表現(xiàn)出優(yōu)良酸耐受性和膽鹽耐受性。菌株具有良好的抑菌能力，對熒光假單胞菌有顯著的抑菌作用。
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