1.2實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1鱖魚蛋白水解物的制備
取新鮮鱖魚肉攪成魚糜，與石油醚按1∶1(g∶mL)的料液比混合，并于40℃慢搖脫脂16 h。收集沉淀魚糜進(jìn)行真空干燥后，加去離子水制成底物濃度為10%的混合物，按0.2%的比例加入風(fēng)味蛋白酶，調(diào)節(jié)pH為7.0，于50℃水浴恒溫振蕩3 h后，90℃水浴滅酶10 min。酶解物經(jīng)離心(8 000 r/min，15 min，4℃)后取上清液進(jìn)行冷凍干燥，-20℃保存，備用。
1.2.2鱖魚多肽-鋅螯合物的制備
取冷凍干燥后的酶解粉用去離子水溶解(40 mg/mL)，按一定比例加入80 mg/mL的ZnSO4·7H2O溶液，用NaOH和HCl調(diào)節(jié)pH為6.0，30℃水浴恒溫振蕩1 h。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液放置室溫下冷卻，離心(8 000×g，15 min)，獲得上清液(S1)和沉淀物(P1)。在S1中加入無水乙醇至體積分?jǐn)?shù)為80%，在4℃條件下靜置1 h后離心(8 000×g，15 min)，得到上清液(S2)和沉淀物(P2)，方法記作“離心-醇沉法”。將反應(yīng)液與乙醇直接按比例混合，然后離心(8 000×g，15 min)，分離上清液(S3)和沉淀(P3)，方法記作“醇沉-離心法”。在蛋白質(zhì)利用率方面，S1=S2+P2;P3=P1+P2。收集螯合物P1、P2和P3，冷凍干燥后-20℃保存，備用。
1.2.3菌懸液的制備
挑取活化后的腐生葡萄球菌單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)16 h，用滅菌生理鹽水將其配制成含菌數(shù)106 CFU/mL的菌懸液，現(xiàn)配現(xiàn)用。
1.2.4抑菌圈
測(cè)定鱖魚多肽-鋅螯合物對(duì)腐生葡萄球菌的抑菌圈。吸取腐生葡萄球菌菌懸液50μL于無菌培養(yǎng)皿中，取15 mL融化的LB固體培養(yǎng)基至含有菌懸液的培養(yǎng)皿中，混合均勻，待冷卻凝固，將牛津杯固定于培養(yǎng)基表面。取50 mg/mL的螯合物溶液200μL于牛津杯中，以加無菌水和酶解液為對(duì)照組，做3組平行試驗(yàn)。37℃條件下培養(yǎng)24 h后用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈的直徑，按照抑菌圈直徑大小進(jìn)行敏感性評(píng)判。
1.2.5最小抑菌濃度
將多肽-鋅螯合物溶解于無菌LB培養(yǎng)液中并進(jìn)行二倍稀釋，使得最終質(zhì)量濃度分別為25、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78、0.39、0.19 mg/mL，依次加入等體積的腐生葡萄球菌菌懸液，以不加菌懸液的為對(duì)照組，做3組平行試驗(yàn)。37℃、150 r/min搖床培養(yǎng)24 h后，測(cè)量在600 nm波長(zhǎng)處的吸光值。
1.2.6生長(zhǎng)曲線
將腐生葡萄球菌菌懸液按1%接種量加至LB液體培養(yǎng)基中，以加入MIC、0.5 MIC和0.25 MIC的鱖魚多肽-鋅螯合物為實(shí)驗(yàn)組，以不加螯合物的為對(duì)照，做3組平行試驗(yàn)。37℃、150 r/min搖床培養(yǎng)24 h。每隔2 h取樣測(cè)量在600 nm波長(zhǎng)處的吸光值，繪制腐生葡萄球菌生長(zhǎng)曲線。
1.2.7電導(dǎo)率值
將鱖魚多肽-鋅螯合物分別加入到腐生葡萄球菌菌懸液中，使得終濃度為MIC和0.5 MIC，并以未加螯合物的為對(duì)照，做3組平行試驗(yàn)。37℃、150 r/min搖床培養(yǎng)8 h，每隔2 h取樣離心(4℃、8 000 r/min、15 min)，取上清液，適當(dāng)稀釋后測(cè)定培養(yǎng)液電導(dǎo)率。
1.2.8紫外吸收值
將鱖魚多肽-鋅螯合物分別加入到腐生葡萄球菌菌懸液中，使得終濃度為MIC和0.5 MIC，并以未加螯合物的為對(duì)照，做3組平行試驗(yàn)。37℃，150 r/min搖床培養(yǎng)8 h，每隔2 h取樣用0.22μm的濾膜過濾，分別檢測(cè)濾液在260 nm和280 nm波長(zhǎng)處的吸光值。
1.2.9超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活力
將鱖魚多肽-鋅螯合物分別加入到腐生葡萄球菌菌懸液中，使得終濃度為MIC、0.5 MIC，以未加螯合物的為空白對(duì)照，做3組平行試驗(yàn)。37℃，180 r/min搖床培養(yǎng)，定時(shí)取樣，低溫超聲2 min，離心(4℃、5 000 r/min、15 min)后取上清液，按試劑盒方法測(cè)定SOD和CAT活力。
1.2.10生物掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope，SEM)
將鱖魚多肽-鋅螯合物分別加入到腐生葡萄球菌菌懸液中，使得終濃度為MIC和0.5 MIC，并以未加螯合物的為空白對(duì)照，37℃，150 r/min搖床培養(yǎng)15 h。培養(yǎng)物經(jīng)離心(4℃、4 000 r/min、10 min)后收集沉淀，用磷酸緩沖液(0.2 mol/L pH 7.0)清洗2次，去上清液，用2.5%(體積分?jǐn)?shù))戊二醛固定液固定樣本，4℃過夜放置。倒出戊二醛溶液，用磷酸緩沖液(0.1 mol/L，pH 7.0)漂洗菌體樣品3次，每次15 min;用1%(體積分?jǐn)?shù))的鋨酸溶液固定樣品1～2 h;倒出鋨酸廢液，用磷酸緩沖液(0.1 mol/L，pH 7.0)漂洗菌體樣品3次，每次15 min;再分別用30%、50%、70%、80%、90%和95%的乙醇溶液對(duì)菌體樣品逐級(jí)脫水，每種濃度均處理15 min，以上操作均在4℃條件下進(jìn)行。在常溫下，再用100%的乙醇繼續(xù)脫水2次，每次20 min。接著用乙醇與醋酸異戊酯的混合液(體積比1∶1)處理樣品30 min，再用純醋酸異戊酯處理樣品。臨界點(diǎn)干燥，鍍膜后使用掃描電鏡觀察拍照。
1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析，多組間數(shù)據(jù)使用單因素方差分析，Duncan’s檢驗(yàn)與LSD法均值多重比較;P<0.05表示存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異;使用Origin 2018作圖。
2結(jié)果與分析
2.1抑菌圈
通過牛津杯法分別測(cè)試了P1、P2和P3對(duì)腐生葡萄球菌的抑菌圈及直徑，如圖1和表1所示。由圖1可知，鱖魚肉酶解液對(duì)腐生葡萄球菌無抑菌效果;3種多肽-鋅螯合物對(duì)腐生葡萄球菌均有一定的抑菌活性，推測(cè)鱖魚多肽-鋅螯合物的抑菌活性可能與鋅離子有關(guān)。其中P3的抑菌效果最好，抑菌圈直徑達(dá)到(21.39±2.46)mm，其次是P2，抑菌圈直徑大小為(17.89±3.06)mm，P1抑菌圈直徑<10 mm，對(duì)腐生葡萄球菌有低敏感度。張鈺源采用濾紙片法測(cè)定大鯢肽與大鯢肽-鋅螯合物對(duì)金黃色葡萄球菌、腐敗希瓦氏菌、大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、枯草芽孢桿菌和變形桿菌的抑菌效果，發(fā)現(xiàn)大鯢肽對(duì)6種菌沒有抑菌活性，而大鯢肽-鋅螯合物對(duì)6種菌均有抑菌活性，研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)論相似。由于P1的抑菌敏感度較低，后續(xù)將重點(diǎn)研究P2和P3的抑菌機(jī)制。
表1鱖魚多肽-鋅螯合物對(duì)腐生葡萄球菌的抑菌圈直徑
注：抑菌圈直徑<10 mm:低敏感或無效，用-代表;10 mm≤抑菌圈直徑<15 mm:中敏感，用+代表;15 mm≤抑菌圈直徑<20 mm:高敏感，用++代表;抑菌圈直徑≥20 mm:極敏感，用+++代表。
A-P1實(shí)驗(yàn)組;B-P2實(shí)驗(yàn)組;C-P3實(shí)驗(yàn)組
圖1鱖魚多肽-鋅螯合物對(duì)腐生葡萄球菌的抑菌圈
注:1、2、3分別表示螯合物、酶解液、無菌水。
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