摘要胞外DNA在土壤中的長(zhǎng)期留存已得到充分證實(shí)，但其對(duì)微生物多度與多樣性分析的干擾卻仍存爭(zhēng)議。這一爭(zhēng)議可能主要源于有關(guān)現(xiàn)有活體微生物研究方法可靠性的認(rèn)知局限。本研究基于在中國(guó)西部地區(qū)所采集的土壤樣品，系統(tǒng)比較了堿性緩沖液洗滌、疊氮溴化丙錠（PMA）處理、DNase預(yù)消化和rRNA直接表征等4種常用方法在表征土壤活體原核生物群落方面的表現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)：胞外DNA的去除顯著影響了原核生物多度、多樣性、群落結(jié)構(gòu)和共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)的解析，但對(duì)群落構(gòu)建機(jī)制解析的影響近乎可以忽略。不同研究方法所表現(xiàn)出的影響卻同樣顯著差異：相比于基于總DNA的研究，DNase預(yù)消化與PMA處理顯著降低了原核生物多度，基于堿性緩沖液洗滌與rRNA直接表征法的分析則未觀(guān)察到顯著差異；DNase預(yù)消化顯著降低了物種豐富度，rRNA直接表征法則增加了原核生物豐富度。盡管67.8%的擴(kuò)增子序列變體（ASVs）為共有類(lèi)群，但基于不同方法所表征的各微生物類(lèi)群的相對(duì)多度存在顯著差異。此外，胞外DNA去除降低了共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性，卻增強(qiáng)了網(wǎng)絡(luò)的魯棒性。DNase預(yù)消化展現(xiàn)出最高的DNA去除效率與活體微生物表征準(zhǔn)確性，而其他方法卻存在去除效率低、結(jié)果穩(wěn)定性差或相關(guān)結(jié)果解釋的不確定性高等問(wèn)題。本研究表明不同方法所表征的活體原核生物群落存在顯著差異，推薦使用DNase預(yù)消化法進(jìn)行土壤活體原核群落研究，這為優(yōu)化微生物組研究方法提供了重要指導(dǎo)。
引言
土壤微生物作為生物地球化學(xué)循環(huán)的核心驅(qū)動(dòng)者，在維持生態(tài)系統(tǒng)功能與健康中發(fā)揮關(guān)鍵作用。當(dāng)前的研究主要依賴(lài)于擴(kuò)增子測(cè)序、宏基因組分析、基因芯片和定量PCR等技術(shù)。值得注意的是，源于裂解微生物的細(xì)胞外DNA可在土壤中持續(xù)存在數(shù)周至數(shù)年，占土壤總DNA庫(kù)的近40%。其存在的時(shí)間受溫度、濕度、pH和有機(jī)質(zhì)等環(huán)境因子調(diào)控：低溫與高有機(jī)質(zhì)含量能夠延緩降解，而高溫高濕的環(huán)境則會(huì)加速分解。然而現(xiàn)行微生物分析多基于總DNA提取，其結(jié)果可能受胞外DNA的干擾。因此，消除胞外DNA的潛在影響成為當(dāng)前土壤微生物組學(xué)研究的重要挑戰(zhàn)。為應(yīng)對(duì)這一挑戰(zhàn)，研究人員開(kāi)發(fā)了一系列方法來(lái)研究活體微生物，包括堿性緩沖液洗滌、疊氮溴化丙錠（PMA）處理、DNase預(yù)消化和rRNA直接表征等。其中堿性洗滌能有效去除胞外DNA，曾是研究活體微生物最常用的方法。
PMA在可見(jiàn)光下與胞外DNA形成不可逆的共價(jià)交聯(lián)，從而抑制后續(xù)PCR擴(kuò)增，而活體細(xì)胞憑借完整膜結(jié)構(gòu)可排斥PMA進(jìn)入，使其DNA得以提取和擴(kuò)增，近年來(lái)PMA處理法在研究土壤活體微生物多度和多樣性方面得到了廣泛應(yīng)用。DNase I作為去除胞外DNA的另一種有效方法，主要通過(guò)水解磷酸二酯鍵降解胞外DNA，也常被用于土壤活體微生物組研究。此外，因rRNA在胞內(nèi)含量高，且在環(huán)境中極不穩(wěn)定，已有學(xué)者提出，rRNA表征法也可用于研究活體微生物群落?？傊?，這些方法原理迥異，可能對(duì)活體微生物群落解析產(chǎn)生顯著有影響。
事實(shí)上，關(guān)于胞外DNA對(duì)微生物多樣性分析的影響，不同方法的研究結(jié)論存在矛盾。例如，基于PMA處理的多項(xiàng)研究都觀(guān)察到胞外DNA顯著影響了土壤微生物多樣性。相比之下，一項(xiàng)基于DNase預(yù)消化法的研究則未觀(guān)察到胞外DNA對(duì)土壤細(xì)菌多樣性的顯著影響。因此，比較和評(píng)估解析土壤活體微生物的常用方法是土壤微生物學(xué)領(lǐng)域的迫切需要。目前，已有一些研究初步評(píng)估了相關(guān)方法在研究土壤活體微生物多度和多樣性方面的效率。然而，相關(guān)研究主要集中于基于純培養(yǎng)菌株或針對(duì)有限數(shù)量環(huán)境樣本的單一方法。
目前，尚未有基于大尺度環(huán)境樣本對(duì)土壤活體微生物研究方法進(jìn)行系統(tǒng)的比較和評(píng)估。因此，本研究基于在中國(guó)西部采集的土壤樣本，系統(tǒng)地比較和評(píng)估了研究活體微生物群落的堿性緩沖液洗滌法、PMA處理法、DNase預(yù)消化法和rRNA直接表征法等4種常用方法。樣點(diǎn)的海拔、年均溫和年均降水量范圍分別為21~4618 m、-6.04~21.83℃和40.7~1565.1 mm。測(cè)定并比較了基于不同方法所表征土壤原核生物的多度、多樣性、共現(xiàn)模式和群落構(gòu)建機(jī)制。
此外，還通過(guò)標(biāo)簽DNA添加實(shí)驗(yàn)評(píng)估了各方法的胞外DNA去除效率，并采用模擬群落驗(yàn)證了各方法在表征活體群落方面的可靠性。本研究重點(diǎn)驗(yàn)證了“不同方法在表征活體原核生物多度與多樣性方面存在顯著差異”這一核心假設(shè)。
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