摘要


抗生素的廣泛使用導(dǎo)致了多種耐藥機(jī)制，嚴(yán)重挑戰(zhàn)了我們治療細(xì)菌感染的能力。在治療中使用的抗生素濃度較高時(shí)，可以選擇耐藥細(xì)菌，但在許多環(huán)境中，抗生素濃度低得多的細(xì)菌在選擇中起到了什么作用仍不清楚。在這里，我們使用高度敏感的競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)表明，耐藥性細(xì)菌的選擇發(fā)生在極低的抗生素濃度下。因此，對(duì)于三種臨床上重要的抗生素，藥物濃度高達(dá)敏感細(xì)菌最低抑制濃度幾百倍以下，即使在初始分?jǐn)?shù)非常低的情況下，也可能富集耐藥細(xì)菌。我們還表明，在亞MIC濃度的抗生素中可以選擇從頭突變株，并且我們提供了一個(gè)數(shù)學(xué)模型，預(yù)測(cè)這種突變株在易感人群中接管的速度。這些結(jié)果為耐藥性的演變?cè)黾恿肆硪粋€(gè)維度，并表明在許多自然環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的低抗生素濃度對(duì)于細(xì)菌種群中耐藥性的富集和維持非常重要。


作者摘要


由于抗生素在人類(lèi)和獸醫(yī)以及農(nóng)業(yè)中的廣泛使用和濫用，抗生素耐藥性已成為一個(gè)非常重要的衛(wèi)生保健問(wèn)題。目前尚不清楚大多數(shù)耐藥細(xì)菌是從何處篩選出來(lái)的，尤其是在治療或促進(jìn)生長(zhǎng)的使用過(guò)程中，自然環(huán)境或人體/動(dòng)物體內(nèi)存在的低抗生素濃度是否對(duì)耐藥突變株的選擇和富集很重要。所提供的數(shù)據(jù)表明，對(duì)于幾種臨床使用的抗生素，極低濃度（與自然環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的濃度相似）可以選擇耐藥細(xì)菌。這些結(jié)果表明，抗生素釋放到環(huán)境中可能是耐藥性產(chǎn)生和維持的重要因素，并強(qiáng)調(diào)了采取措施減少抗生素污染的重要性。


介紹


抗生素是人類(lèi)最重要的醫(yī)學(xué)發(fā)明之一，但在過(guò)去幾十年中，抗生素耐藥性的持續(xù)快速發(fā)展已成為社區(qū)和醫(yī)院環(huán)境中最嚴(yán)重的衛(wèi)生保健問(wèn)題之一[1,2,3]。然而，一些產(chǎn)生耐藥性的基因最有可能最初被選擇用于代謝功能和/或信號(hào)傳輸或?qū)垢?jìng)爭(zhēng)性抗生素產(chǎn)生菌的保護(hù)[4]，最近在全球范圍內(nèi)，微生物圈中高抗藥性致病細(xì)菌的富集和傳播在很大程度上是由人類(lèi)活動(dòng)推動(dòng)的，包括在人類(lèi)和獸醫(yī)以及農(nóng)業(yè)中廣泛使用和濫用抗生素[2,3,5,6,7]。雖然在治療上使用的高濃度抗生素顯然可以選擇耐藥突變株，但由于人為輸入污染自然（如水生或土壤）環(huán)境的低抗生素濃度有多重要仍不清楚[8,9,10]，由產(chǎn)生抗生素的微生物自然產(chǎn)生的，或在治療或促生長(zhǎng)使用期間存在于某些人體/動(dòng)物體內(nèi)的，用于選擇和富集抗性突變體。在藥效學(xué)模型中，通常假設(shè)僅在易感野生型種群（MICsusc）和耐藥菌（MICres）[11,12]（突變選擇窗假說(shuō)，見(jiàn)圖1A）的最小抑制濃度（MIC）和以下濃度之間的濃度下，才會(huì)選擇耐藥菌MICSUC不會(huì)抑制易感細(xì)菌的生長(zhǎng)，因此不具有選擇性。早期關(guān)于細(xì)菌對(duì)抗生素敏感性存在微小差異的選擇的研究表明，選擇可以有效地根據(jù)微小差異進(jìn)行耐藥性選擇[13,14,15]。此外，最近的一項(xiàng)研究使用一種優(yōu)雅的基于顏色的分析定性地表明，MIC以下的抗生素水平可以富集耐藥細(xì)菌[16]。在此，我們進(jìn)一步探索突變選擇性窗口假設(shè)，如圖1A所示，我們研究了兩種細(xì)菌和三種抗生素，由于敏感突變株的生長(zhǎng)速度略有下降，它們的選擇性富集程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于MICSUC預(yù)先存在和從頭生成的耐藥突變株。


為了確定暴露于極低抗生素濃度（、、MICsusc）是否會(huì)導(dǎo)致耐藥突變株的富集，我們使用了大腸桿菌和腸道沙門(mén)氏菌（鼠傷寒變種LT2）（正文S1中的表S1）的幾種定義明確的突變體，以及對(duì)人類(lèi)和獸醫(yī)具有高度重要性的三種不同類(lèi)別的抗生素（四環(huán)素類(lèi)、氟喹諾酮類(lèi)和氨基糖苷類(lèi)）。使用的耐藥標(biāo)記物是Tn10dTet（賦予四環(huán)素耐藥性）、gyrA（S83L和D87N）、DmarR和DacrR突變（賦予環(huán)丙沙星耐藥性）和rpsL（賦予鏈霉素耐藥性），所有這些都在幾種不同細(xì)菌的臨床分離株中發(fā)現(xiàn)。利用敏感菌株和耐藥菌株的等基因?qū)χg的高度敏感競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)，我們表明，在遠(yuǎn)低于最低抑菌濃度的抗生素濃度下，可以選擇耐藥細(xì)菌。最后，我們提出了一個(gè)數(shù)學(xué)模型，展示了耐藥突變體如何在這些抗生素的亞MIC水平下從頭出現(xiàn)并在細(xì)菌種群中傳播。


為了確定暴露于極低抗生素濃度（、、MICsusc）是否會(huì)導(dǎo)致耐藥突變株的富集，我們使用了大腸桿菌和腸道沙門(mén)氏菌（鼠傷寒變種LT2）（正文S1中的表S1）的幾種定義明確的突變體，以及對(duì)人類(lèi)和獸醫(yī)具有高度重要性的三種不同類(lèi)別的抗生素（四環(huán)素類(lèi)、氟喹諾酮類(lèi)和氨基糖苷類(lèi)）。使用的耐藥標(biāo)記物是Tn10dTet（賦予四環(huán)素耐藥性）、gyrA（S83L和D87N）、DmarR和DacrR突變（賦予環(huán)丙沙星耐藥性）和rpsL（賦予鏈霉素耐藥性），所有這些都在幾種不同細(xì)菌的臨床分離株中發(fā)現(xiàn)。利用敏感菌株和耐藥菌株的等基因?qū)χg的高度敏感競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)，我們表明，在遠(yuǎn)低于最低抑菌濃度的抗生素濃度下，可以選擇耐藥細(xì)菌。最后，我們提出了一個(gè)數(shù)學(xué)模型，展示了耐藥突變體如何在這些抗生素的亞MIC水平下從頭出現(xiàn)并在細(xì)菌種群中傳播。


結(jié)果


在單一培養(yǎng)基中對(duì)低抗生素濃度的影響進(jìn)行了初步檢查，其中在不同濃度四環(huán)素的存在下分別培養(yǎng)了攜帶Tn10dTet的易感野生型和耐藥突變體。如圖1B和文本S1中的表S2所示，遠(yuǎn)低于MICsusc的濃度降低了敏感菌株的指數(shù)增長(zhǎng)率，而對(duì)抗性菌株沒(méi)有任何明顯影響。例如，在MICsusc濃度為1/30時(shí)，易感菌株的生長(zhǎng)速度比不使用抗生素的菌株慢約15%，而耐藥突變株似乎未受影響，這表明在這些低濃度下，耐藥菌株被強(qiáng)烈選擇。為了提高這些檢測(cè)的靈敏度，并允許檢測(cè)到生長(zhǎng)率的極小差異，我們?cè)诿舾芯旰湍退幘曛g進(jìn)行了競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)。敏感和耐藥突變株的MIC分別為：鼠傷寒沙門(mén)氏菌野生型（鏈霉素=4μg/ml，四環(huán)素=1.5μg/ml）、rpsL K42R.1024μg/ml和Tn10dTet菌株=128μg/ml；大腸桿菌野生型（環(huán)丙沙星=0.023 ug/ml）、gyrA S83L（環(huán)丙沙星=0.38 ug/ml）、gyrA D87N（環(huán)丙沙星=0.25 ug/ml）、DacrR（環(huán)丙沙星=0.047 ug/ml）和DmarR（環(huán)丙沙星=0.047 ug/ml）。這些菌株被綠色熒光蛋白基因的變體（yfp和cfp，分別編碼黃色和青色熒光蛋白）基因標(biāo)記，以便通過(guò)熒光激活細(xì)胞分選（FACS）對(duì)大量競(jìng)爭(zhēng)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，從而顯著減少與小群體計(jì)數(shù)相關(guān)的任何實(shí)驗(yàn)誤差。除了抗性決定簇和產(chǎn)生相應(yīng)熒光蛋白的yfp和cfp基因外，競(jìng)爭(zhēng)菌株均為等基因。對(duì)照實(shí)驗(yàn)表明，cfp和yfp標(biāo)記之間的適應(yīng)成本差異對(duì)生長(zhǎng)率的影響可以忽略不計(jì)（圖S1）。在不同濃度的抗生素四環(huán)素、環(huán)丙沙星（一種氟喹諾酮）和鏈霉素（一種氨基糖苷）以及不含藥物的情況下（圖2A-D、圖3A-H、圖4A-E），通過(guò)分批培養(yǎng)連續(xù)傳代，這些菌株競(jìng)爭(zhēng)多達(dá)80代。正如我們之前的研究[17]所示，這種實(shí)驗(yàn)裝置允許檢測(cè)至少小到0.3%的生長(zhǎng)率差異，這接近由周期性選擇事件干擾設(shè)定的靈敏度極限。圖1B所示的生長(zhǎng)率測(cè)量?jī)H測(cè)量了生長(zhǎng)的指數(shù)階段，而競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)代表了生長(zhǎng)和存活在滯后階段、指數(shù)階段和穩(wěn)定階段的組合，允許檢查整個(gè)生長(zhǎng)周期。

圖1。生長(zhǎng)率是抗生素濃度的函數(shù)。（A）生長(zhǎng)率隨抗生素濃度變化的示意圖。綠色表示易感菌株（藍(lán)線）將超過(guò)抗性菌株（紅線）的濃度區(qū)間。橙色（亞MIC選擇窗口）和紅色（傳統(tǒng)突變選擇窗口）表示抗性菌株將超過(guò)敏感菌株的濃度區(qū)間。MICsusc=敏感菌株的最小抑制濃度，MICres=抗性菌株的最小抑制濃度，MSC=最小選擇濃度。（B）。作為四環(huán)素濃度的函數(shù)，鼠傷寒沙門(mén)氏菌敏感（開(kāi)放循環(huán)）和抗性（封閉循環(huán)）菌株的相對(duì)指數(shù)增長(zhǎng)率。顯示了平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。相對(duì)增長(zhǎng)率為1.0相當(dāng)于約1.8 hr21。細(xì)胞在37℃的Mueller-Hinton培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。doi:10.1371/期刊。ppat。1002158.g001


圖2A、C、圖3A、C、E、G和圖4A-D所示的數(shù)據(jù)顯示了耐藥菌株與敏感菌株的比率是如何隨著不同濃度抗生素下的生長(zhǎng)世代數(shù)而變化的。每條線代表一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)，斜率是選擇系數(shù)（s值）的度量。因此，在沒(méi)有抗生素的情況下獲得的負(fù)斜率是抗生素耐藥機(jī)制適應(yīng)成本的度量，而正斜率表明耐藥突變體得到了富集。當(dāng)從這些實(shí)驗(yàn)中獲得的s值繪制為抗生素濃度的函數(shù)時(shí)，截距s=0，表示我們指定的最小選擇濃度（MSC），其中抗性的適應(yīng)成本通過(guò)抗性突變體（圖2B、D、圖3B、D、F、H和圖4E）的抗生素選擇來(lái)平衡。根據(jù)所檢測(cè)的抗生素和耐藥突變類(lèi)型，MSC在MICSUC的1/4到1/230之間變化。對(duì)于鏈霉素，MSC值為敏感菌株（圖2B）MIC值的1/4，對(duì)于四環(huán)素1/100（圖2D）和環(huán)丙沙星，其在MICSUC的1/10（圖3B）和1/230（圖3D）之間變化，取決于特定的抗性突變。這些值對(duì)應(yīng)于1 mg/ml（鏈霉素）、15 ng/ml（四環(huán)素）和2.5 ng/ml至100 pg/ml（環(huán)丙沙星）的絕對(duì)抗生素濃度。對(duì)一小部分抗性突變體進(jìn)行的競(jìng)爭(zhēng)也表明，選擇系數(shù)與抗性突變體的初始頻率無(wú)關(guān)。即使在初始頻率低至1024的情況下，也可以觀察到抗性突變體以1:1的比例富集（即相同的選擇系數(shù)）（比較圖2D和4E）。

圖2。敏感菌株和耐藥菌株、鏈霉素和四環(huán)素之間的競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)。在不同濃度的抗生素（A（rpsL105（K42R））和C（Tn10dtet）下進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)，并計(jì)算選擇系數(shù)作為抗生素濃度（B和D）的函數(shù)。圖A和圖C分別基于一次比賽實(shí)驗(yàn)（四次比賽的平均值），而圖B和圖D則根據(jù)多達(dá)20次比賽的選擇系數(shù)計(jì)算（文本S1中的表S3）。顯示了平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。doi:10.1371/期刊。ppat。1002158.g002


由于抗性突變體可以從極低的初始組分（1024）中富集，我們還測(cè)試了是否可以從易感群體中從頭選擇抗性突變體。為此，我們?cè)阪溍顾豈IC的1/4下培養(yǎng)了20個(gè)易感野生型鼠傷寒沙門(mén)氏菌LT2菌株的獨(dú)立譜系700代，并通過(guò)在不同濃度的鏈霉素上電鍍連續(xù)篩選耐藥細(xì)胞。在這種低水平的抗生素下，我們可以觀察到新發(fā)耐藥突變體的快速富集（圖5）。因此，在200至400代內(nèi)，可以看到大量抗性在起始菌株MIC（8–64 mg/ml）的2至16倍之間的突變體，在500至600代后，也出現(xiàn)了高水平抗性突變體（野生型MIC的24–32倍=96–128 mg/ml）。400代后，所有20個(gè)譜系都含有MIC高于32 mg/ml（8倍MIC）的亞群，600代后，14個(gè)譜系的MIC高于64 mg/ml（16倍MIC）的亞群。使用上述方法，20個(gè)野生型大腸桿菌譜系在亞MIC水平的環(huán)丙沙星中生長(zhǎng)了600代。在以MIC的1/10生長(zhǎng)500代后，其中五個(gè)譜系的亞種群（占種群的1%）對(duì)環(huán)丙沙星具有低水平抗性（MIC比易感親本菌株高2倍），600代后，每20個(gè)譜系中就有一個(gè)細(xì)胞亞群的MIC比易感親本菌株高8倍（見(jiàn)圖S2）。


圖3。敏感菌株和耐藥菌株環(huán)丙沙星之間的競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)。在不同濃度的環(huán)丙沙星（A（gyrA2（D87N））、C（gyrA1（S83L））、E（DacrR）和G（DmarR））下進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)，并計(jì)算選擇系數(shù)作為抗生素濃度（B、D、F和H）的函數(shù)。圖A、C、E和G分別基于一次競(jìng)賽實(shí)驗(yàn)（三次競(jìng)賽的平均值），而圖B、D、F和H則根據(jù)6次競(jìng)賽的選擇系數(shù)計(jì)算（文本S1中的表S3）。顯示了平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。doi:10.1371/期刊。ppat。1002158.g003


我們還計(jì)算了（正文S1中的附錄）在低抗生素濃度下，由突變率（u）、群體規(guī)模（N）和抗生素存在時(shí)的適應(yīng)性?xún)?yōu)勢(shì)（s）決定的新產(chǎn)生的耐藥突變體在易感人群中接管的速度。s取決于MSC上方的抗生素濃度，如圖2和圖3所示。當(dāng)最初不存在抗性突變體時(shí)，固定時(shí)間可以表示為



第一項(xiàng)是第一個(gè)存活突變體出現(xiàn)的隨機(jī)等待時(shí)間，第二項(xiàng)是從隨后的生長(zhǎng)到50%的存在。對(duì)于較小的uN值0.1，第一項(xiàng)占主導(dǎo)地位，固定速度可能較慢。對(duì)于較大的值，uN.1，第二項(xiàng)占主導(dǎo)地位，固定可能很快，在0.1-0.01之間的s約為100-1000代（圖6）。在這個(gè)限度內(nèi)，抗性突變體出現(xiàn)的頻率如此之高，以至于如果它們最初出現(xiàn)與否，對(duì)固定時(shí)間幾乎沒(méi)有影響。在這種情況下，值得注意的是，幾種抗生素的亞MIC水平（對(duì)氟喹諾酮類(lèi)藥物最為明顯）已被證明會(huì)增加細(xì)菌突變率，這可能會(huì)縮短等待時(shí)間，從而增加突變接管率[18]。



圖4。用低初始頻率的抗性突變體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)。在不同濃度的抗生素和耐藥突變體的不同起始組分下進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)。（A）對(duì)抗性突變體敏感的初始比例為10:1。（B）對(duì)抗性突變體敏感的初始比例為102:1。（C）對(duì)抗性突變體敏感的初始比例為103:1。（D）對(duì)抗性突變體敏感的初始比例為104:1。（E）計(jì)算選擇系數(shù)作為抗生素濃度的函數(shù)。圖A至圖D分別基于一個(gè)單一競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)，而E則根據(jù)24個(gè)獨(dú)立競(jìng)爭(zhēng)的選擇系數(shù)計(jì)算得出，其中有四個(gè)不同的抗性突變體起始部分（文本S1中的表S3）。顯示了平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。doi:10.1371/期刊。ppat。1002158.g004

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