1.3實驗方法
1.3.1耐凍酵母的分離篩選
將收集到的老面樣本，于-18℃冷凍保藏48 h，取出融化后繼續(xù)冷凍，循環(huán)5次。凍融結(jié)束后，將樣品稀釋到10-3～10-6梯度在YPD平板上進(jìn)行純化分離。通過顯微鏡下10×40倍觀察菌株細(xì)胞形態(tài)，結(jié)合嗅聞法篩選具有酵母菌特征和明顯香味的菌株。在本研究中，共得到5株不同菌落形態(tài)和香氣特征的酵母菌株，將其標(biāo)記為Y1～Y5，純化接種后4℃保藏。
1.3.2酵母生長曲線的測定
將5株酵母于28℃下活化24 h，吸取1 mL活化后的菌液，接種到500 mL的YPD液體培養(yǎng)基中，每2 h取樣，在波長600 nm處測定吸光度值。
1.3.3耐凍酵母發(fā)酵力的測定
采用排水法測定不同酵母菌發(fā)酵力。將100 g高筋小麥面粉，3 g酵母菌菌體(數(shù)量級均在109 CFU/g)，6 g糖，0.6 g鹽和60 g蒸餾水混勻，置于和面機(jī)中，攪拌成型。分割成50 g小面團(tuán)，填實于密閉瓶中，28℃、相對濕度75%條件下發(fā)酵，每30 min記錄1次排水體積，繪制發(fā)酵力曲線圖，其余面團(tuán)用于后續(xù)實驗。
1.3.4冷凍面團(tuán)的制備及酵母細(xì)胞存活率測定
參考XU等的方法并修改，將添加了酵母Y1～Y5的面團(tuán)，在35℃，相對濕度75%條件下預(yù)發(fā)酵10 min后在-80℃急凍冰箱中快速冷凍，當(dāng)樣本核心溫度達(dá)到-18℃后，轉(zhuǎn)入-18℃冰箱中，冷凍120 d，每20 d測定1次酵母菌存活率。根據(jù)與新鮮面團(tuán)酵母活菌數(shù)比值計算酵母細(xì)胞存活率。
1.3.5面團(tuán)比容、質(zhì)構(gòu)的測定
將上述冷凍40 d面團(tuán)取出后，于醒發(fā)箱(35℃，相對濕度75%)醒發(fā)20 min后蒸制20 min，冷卻后參考GB/T 21118—2007《小麥粉饅頭》測定面團(tuán)比容。
將冷卻后的面團(tuán)均勻切割為2 cm×2 cm×1 cm規(guī)格進(jìn)行質(zhì)構(gòu)測定。選用TPA模式，采用P/50探頭進(jìn)行壓縮試驗。試驗參數(shù):測前速度2.00 mm/s，測試速度1.00 mm/s，測后速度1.00 mm/s，壓縮程度50%，觸發(fā)力5 g，壓縮間隔5 s。
1.3.6耐凍酵母的分子生物學(xué)鑒定
將所篩選具有耐凍產(chǎn)香功能的酵母菌，培養(yǎng)成熟后采用Omega M5635真菌DNA提取試劑盒進(jìn)行提取。酵母菌采用引物26SF(5-GCATATCGGTAAGCGGAGGAAAAG-3)，26SR(5-GGTCCGTGTTTCAAGAC-GG-3)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物由上海派森諾生物科技有限公司測序，序列利用BLAST程序在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，利用Mega 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。
1.3.7酵母菌發(fā)酵面團(tuán)感官品質(zhì)的測定
將篩選的耐凍產(chǎn)香酵母菌與3種市售酵母菌劑在相同條件下制備面團(tuán)，冷凍40 d，取出后，于醒發(fā)箱(35℃，相對濕度75%)醒發(fā)20 min后蒸制20 min，冷卻后參考國標(biāo)GB/T 35991—2018《糧油檢驗小麥粉饅頭加工品質(zhì)評價》中饅頭品質(zhì)評分項目，選擇10名食品專業(yè)相關(guān)人員，按評定表1對熟面團(tuán)進(jìn)行感官評定。
表1冷凍面團(tuán)感官評定表
1.3.8發(fā)酵面團(tuán)香氣成分測定
香氣萃取:稱取3 g蒸制的面團(tuán)于頂空萃取瓶中，置于80℃恒溫水浴鍋中，待樣品完全解凍且溫度穩(wěn)定，平衡20 min。萃取頭插入頂空萃取瓶中吸附40 min后開始進(jìn)樣分析，解析8 min。
GC條件:使用氣相色譜柱，以He為載氣，進(jìn)樣口溫度為250℃，不分流進(jìn)樣，流速1.0 mL/min，升溫程序:40℃保持3 min，以4℃/min升溫至200℃，5℃/min升至230℃，保留5 min。
MS條件:電子電離源;電子能量70 eV;離子源溫度230℃;接口溫度250℃;質(zhì)量掃描范圍35～400 u。
1.4數(shù)據(jù)處理
采用SPSS 25.0、Excel 2019軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)相關(guān)性統(tǒng)計分析，結(jié)果用origin 21軟件作圖表示。偏最小二乘判別分析(partial least squares discriminant analysis，PLS-DA)采用SIMCA 14.1繪制。每組樣本進(jìn)行3次平行測定。
2結(jié)果與分析
2.1不同酵母的生長曲線、發(fā)酵力、耐凍性能的測定
傳統(tǒng)老面團(tuán)中微生物具有復(fù)雜性，包含多種與風(fēng)味和品質(zhì)存在顯著關(guān)聯(lián)性的微生物，被廣泛用于特色發(fā)酵菌株的篩選。如圖1所示，實驗前期篩選了5株具有耐凍、產(chǎn)香特性的酵母菌，測定了菌株的生長曲線、發(fā)酵力及凍藏后存活率。5株菌株的OD值隨培養(yǎng)時間延長呈先增加后降低的趨勢，其中8～24 h微生物生長明顯加快，這與李歡歡等的研究結(jié)果一致，該階段酵母菌以指數(shù)增長的速率繁殖，利于酵母菌的收集。Y2在4～32 h的OD值始終高于其他幾株酵母，并且在20 h即達(dá)到生長最高點，說明Y2酵母生長速率較其他菌株更快。
a-生長曲線;b-發(fā)酵力;c-冷凍后存活率
圖1不同酵母菌的生長曲線、發(fā)酵力及冷凍后存活率
酵母菌在繁殖代謝過程中，水解糖經(jīng)發(fā)酵釋放CO2，通過測定發(fā)酵力評判酵母菌產(chǎn)氣能力的強(qiáng)弱，對于冷凍生坯面團(tuán)醒發(fā)具有重要作用，發(fā)酵力越強(qiáng)的菌株，能夠使面團(tuán)在發(fā)酵期間產(chǎn)生大量氣體膨脹，質(zhì)地更加松軟。如圖1-b所示，各株酵母菌在30 min前產(chǎn)氣量差異較小，隨后產(chǎn)氣量顯著增長，在180 min后逐漸穩(wěn)定，5株菌株當(dāng)中Y2發(fā)酵力最強(qiáng)。
面團(tuán)在低溫冷凍過程中，冷凍脅迫對酵母細(xì)胞具有嚴(yán)重破壞性，酵母菌會受凍融、高滲透壓和氧化應(yīng)激等各種條件協(xié)同影響，引起細(xì)胞凋亡。如圖1-c所示，各面團(tuán)在0～60 d時間內(nèi)酵母菌存活率快速下降，隨后下降趨勢放緩。酵母細(xì)胞存活率曲線趨勢與劉海東等對酵母菌多次凍融后的結(jié)果相似，由于凍藏過程中在高滲、低溫及冰晶帶來的機(jī)械損傷下，酵母菌細(xì)胞膜的組成和結(jié)構(gòu)完整性受到影響，另一方面冰晶的形成使胞外基質(zhì)濃度升高，胞內(nèi)滲透壓增大，導(dǎo)致細(xì)胞迅速脫水死亡。而隨著凍藏時間的延長，冷凍耐受型酵母菌能夠通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)，以反滲透作用將細(xì)胞內(nèi)水分快速排出胞外，以減少胞內(nèi)冰晶形成和對細(xì)胞傷害。同時耐冷凍酵母能夠通過積累代謝物如胞內(nèi)海藻糖等方式保護(hù)細(xì)胞免受損傷。Y2在整個凍藏過程中存活率均高于其余菌株，證明了該酵母具有較強(qiáng)的抗凍穩(wěn)定性。
2.2耐凍酵母對面團(tuán)比容及質(zhì)構(gòu)特性的影響
傳統(tǒng)冷凍面團(tuán)儲藏過程中不可避免的會導(dǎo)致面團(tuán)品質(zhì)劣化，適口性降低。冷凍引起組織水分分布狀態(tài)改變，結(jié)合水向可凍結(jié)水轉(zhuǎn)化，冰晶數(shù)量的增多以及重結(jié)晶的不斷出現(xiàn)使面筋網(wǎng)絡(luò)遭到破壞，導(dǎo)致產(chǎn)品硬度增加、出現(xiàn)開裂現(xiàn)象，因此酵母菌二次醒發(fā)過程對面團(tuán)質(zhì)構(gòu)的維持至關(guān)重要。由表2可知，5株酵母發(fā)酵的冷凍面團(tuán)中，Y2組比容和高徑比顯著高于其他面團(tuán)(P<0.05)，咀嚼性為372.32 mJ，硬度為611.73 g，顯著低于其他樣本(P<0.05)。楊錦勝等、蘇安祥等研究結(jié)果表明，硬度與咀嚼性在一定范圍內(nèi)與面團(tuán)的食用品質(zhì)呈負(fù)相關(guān)性，即硬度和咀嚼性數(shù)值越大，面團(tuán)口感越差。這是由于冷凍復(fù)蒸后面團(tuán)的持水力減弱，導(dǎo)致硬度和咀嚼性增大，使得面團(tuán)缺乏綿軟口感。因此Y2發(fā)酵面團(tuán)冷凍后的質(zhì)構(gòu)特性要優(yōu)于其他菌株，表明了其良好的耐冷凍和快速產(chǎn)氣性能，這與之前的發(fā)酵力和存活率測定結(jié)果一致。
表2不同冷凍面團(tuán)的比容和質(zhì)構(gòu)特性
注:同列不同小寫字母表示存在顯著性差異(P<0.05)。
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