1.5 TCGA數(shù)據(jù)庫分析
分析TCGA數(shù)據(jù)庫中膀胱癌的生存數(shù)據(jù)和目的基因的預(yù)后相關(guān)性。
1.6慢病毒轉(zhuǎn)染實驗
為構(gòu)建穩(wěn)定敲低表達CLDN10的膀胱癌細胞株，將含sh-CLDN10的慢病毒質(zhì)粒(Lipofectamine3000，Invotrigen，美國)感染293-T細胞，72 h后收集病毒液。然后將病毒液感染膀胱癌T24細胞，48 h后在顯微鏡下觀察熒光蛋白的表達情況。確認轉(zhuǎn)染成功后將T24細胞用胰酶消化，分裝凍存。將敲低表達CLDN10膀胱癌T24細胞作為敲低CLDN10組，以未轉(zhuǎn)染的膀胱癌T24細胞作為對照組。
1.7 CCK-8檢測
用Bioscreen C 公司全自動生長曲線分析儀檢測細胞生長情況。96孔板培養(yǎng)細胞，待細胞長到80%~90%時，按預(yù)先設(shè)計的時間點測定細胞的生長值，在時間點之前30~120 min每孔加入20μL CCK-8試劑(100μL培養(yǎng)基加入10μL試劑)，繼續(xù)培養(yǎng)。采用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測量各孔光密度值，然后根據(jù)所測值計算并繪制生長曲線。
1.8細胞克隆實驗
接種細胞到6孔板，每孔接種約500個細胞，培養(yǎng)5~7 d后肉眼可見克隆時，甲醇固定30 min、結(jié)晶紫液染色30 min后，在鏡下觀察細胞克隆數(shù)。
1.9統(tǒng)計學(xué)分析
采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件包分析和處理數(shù)據(jù)，每組實驗獨立重復(fù)3次，實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，采用兩獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
2結(jié)果
2.1免疫組化檢測膀胱癌組織中免疫細胞的浸潤情況
免疫組化結(jié)果表明，除CD3、CD8外，巨噬細胞表面特征性CD68分子在癌細胞周圍的間質(zhì)中染色呈強陽性，而CD68在癌旁正常組織中的染色呈陰性(圖1)。
A：膀胱癌組織；B：癌旁組織
圖1膀胱癌組織及癌旁組織中免疫細胞表面特征性分子的表達
2.2免疫組化檢測膀胱癌組織中巨噬細胞的浸潤情況
免疫組化結(jié)果表明，M2巨噬細胞表面特征性分子CD163在膀胱癌組織中表達呈強陽性，而M1巨噬細胞表面特征性分子iNOS則表達陰性(圖2A)；iNOS和CD163分子在癌旁正常組織表達陰性(圖2B)。
A：膀胱癌組織；B：癌旁組織
圖2巨噬細胞表面特征性分子在膀胱癌組織的表達
2.3膀胱癌及癌旁組織全轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果
對10對膀胱癌及對應(yīng)癌旁組織進行轉(zhuǎn)錄組測序，結(jié)果表明，癌組織和癌旁組織間有4 640個差異表達基因(Fold change>2，F(xiàn)DR<0.05，圖3A)。采用軟件分析篩選出膀胱癌組織中巨噬細胞浸潤高低兩組間的差異表達基因(圖3B)。將A、B兩組基因進行交叉性分析，篩選出兩者間共同調(diào)控的表達基因，其中CLDN10基因表達明顯升高，最為顯著(圖3C)。
A：癌組織和癌旁組織間的基因表達差異；B：巨噬細胞浸潤評分高低兩組間的基因表達差異；C：軟件分析篩選出A、B兩組間的共同差異表達基因
圖3兩組間基因表達差異熱圖
2.4免疫組化檢測CLDN10在膀胱癌組織的表達部位
為明確CLDN10在膀胱癌組織的表達部位，選取膀胱癌組織石蠟切片進行IHC實驗，結(jié)果顯示，CLDN10表達于膀胱癌細胞的胞質(zhì)和胞膜部位(圖4)。
圖4免疫組化檢測CLDN10在膀胱癌組織的表達
2.5 Western blot檢測CLDN10在膀胱癌組織中的表達
提取10對膀胱癌組織的蛋白液后進行Western blot檢測，結(jié)果顯示，CLDN10蛋白在膀胱癌組織中的表達升高，而在癌旁組織中表達相對較低(P<0.05，圖5)。
A：Western blot檢測結(jié)果T：膀胱癌組織；N：癌旁組織；1~10：為標(biāo)本序號；B：蛋白半定量分析a：P<0.05，與癌組織比較
圖5 Western blot檢測CLDN10在膀胱癌和癌旁組織中的表達
2.6 CLDN10促進膀胱癌細胞的生長和增殖
為探討CLDN10在膀胱癌細胞生長和增殖中的作用情況，首先用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法構(gòu)建穩(wěn)定低表達CLDN10的膀胱癌T24細胞株(圖6A)。然后用CCK-8試劑檢測膀胱癌細胞的生長能力，平板克隆實驗檢測膀胱癌細胞的增殖能力。結(jié)果表明，與對照組相比，敲低CLDN10組膀胱癌細胞的生長能力明顯減弱(圖6B)，細胞克隆形成數(shù)目明顯減少(198.0±10.3 vs 145.0±8.4，P<0.05，圖6C)。
A：Western blot驗證穩(wěn)定敲低CLDN10的膀胱癌T24細胞株；B：CCK-8檢測膀胱癌細胞的生長曲線；C：平板克隆實驗檢測膀胱癌細胞的克隆形成能力(n=3)
圖6檢測敲低CLDN10表達后膀胱癌細胞的生長和增殖能力變化
2.7 TCGA數(shù)據(jù)庫中CLDN10與膀胱癌患者的預(yù)后分析
利用TCGA數(shù)據(jù)庫分析CLDN10與膀胱癌患者的預(yù)后，結(jié)果顯示CLDN10高表達的患者預(yù)后較差(圖7)。
圖7 TCGA數(shù)據(jù)庫中CLDN10與膀胱癌患者預(yù)后的關(guān)系
2.8敲低CLDN10后膀胱癌細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)相關(guān)蛋白的表達
為檢測敲低CLDN10對膀胱癌細胞EMT的影響，用Western blot檢測膀胱癌細胞中部分EMT相關(guān)蛋白的表達情況。結(jié)果顯示，敲低膀胱癌T24細胞CLDN10的表達后，Snail1、Vimentin、Twist蛋白表達水平下降，而E-cadherin蛋白表達水平升高(圖8)。
a：P<0.05，與對照組比較
圖8 Western blot檢測膀胱癌細胞內(nèi)部分EMT指標(biāo)蛋白表達水平
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