摘要
目的:未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)UPR是酵母最重要蛋白質(zhì)質(zhì)量控制機(jī)制之一,研究UPR響應(yīng)規(guī)律有助于優(yōu)化異源蛋白分泌途徑合成和應(yīng)對酸醇等脅迫因子的細(xì)胞自我保護(hù)。方法:選擇實(shí)驗(yàn)室菌株W303-1A和工業(yè)菌株An-a,以UPRE啟動子控制下的Lac Z為報告基因,利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建得到指示菌株W303-1A(leu 2::UPRE-lac Z)和An-a(leu 2::UPRE-lac Z),分別簡稱WZ和AZ。結(jié)果:生長曲線測定顯示W(wǎng)Z和AZ與親本菌株的生長接近;添加下述試劑孵育4h后測定β-半乳糖苷酶酶活:1μg/ml衣霉素、8%(v/v)乙醇、0.3%(v/v)乙酸、5%(v/v)乙醇+0.1%(v/v)乙酸;菌株AZ的比酶活分別是對照值的8.2、26.4、1.1和7.9倍,而菌株WZ則分別為12.6、2.4、1.0和1.0倍;進(jìn)一步以YEplac195為載體表達(dá)β-葡萄糖苷酶,AZ和WZ轉(zhuǎn)化子在2%纖維二糖中生長24h的β-葡萄糖苷酶酶活值分別為0.35和6.12U/ml,相應(yīng)的LacZ則分別為對照值的3.1和5.4倍。結(jié)論:兩個菌株顯示了在抑制物和異源蛋白表達(dá)UPR響應(yīng)和調(diào)控能力上的顯著差異,為其改造利用提供了方向;研究也為分析抑制物耐受性和異源蛋白表達(dá)關(guān)鍵制約因素、優(yōu)化酵母ER和UPR信號通路的調(diào)控奠定了初步方法基礎(chǔ)。
釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作為真核模式生物和最重要的真核微生物細(xì)胞工廠,多年來被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)及生物學(xué)研究,近年來更是越來越廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥蛋白和工業(yè)應(yīng)用蛋白的異源分泌表達(dá)。而酵母中的分泌途徑(secretory pathway)蛋白質(zhì)表達(dá),不論內(nèi)源性的表達(dá)還是異源性的表達(dá),都涉及蛋白質(zhì)的定向、轉(zhuǎn)位和轉(zhuǎn)運(yùn),受到酵母細(xì)胞自身蛋白質(zhì)質(zhì)量控制系統(tǒng)(protein quality control)的調(diào)控和制約。作為最重要質(zhì)量控制機(jī)制之一的未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR),當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum,ER)中大量積累未折疊或錯誤折疊蛋白質(zhì)時會被激活,在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中催化分泌蛋白質(zhì)折疊、裝配和修飾的酶,確保正確折疊和裝配完全的復(fù)合體繼續(xù)通過分泌途徑,而不能正確折疊和裝配完全的蛋白質(zhì),則在另一質(zhì)量控制機(jī)制-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)關(guān)聯(lián)降解(ER-associated degradation,ERAD)的共同作用下被降解。
UPR維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)和恢復(fù)細(xì)胞功能,是酵母中非常保守的一種細(xì)胞自我保護(hù)性措施,但是,過強(qiáng)或者持續(xù)時間過久的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,會使UPR從保護(hù)細(xì)胞生存反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)榇俚蛲龇磻?yīng),最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。異源蛋白質(zhì)在酵母中的分泌途徑表達(dá),也會導(dǎo)致ER壓力、觸發(fā)UPR響應(yīng),從而制約最終的產(chǎn)量和質(zhì)量。為了提高宿主的ER加工容量,緩解ER脅迫壓力,人們對酵母分泌途徑進(jìn)行改造和優(yōu)化,選擇性地高表達(dá)異源蛋白加工修飾過程的關(guān)鍵蛋白元件,包括強(qiáng)化促進(jìn)正確折疊的分泌元件,以突破各個關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的限制,進(jìn)而提高酵母異源蛋白胞外分泌或錨定表達(dá)的效率。
在生物質(zhì)燃料乙醇領(lǐng)域,由于底物的特殊性,分泌途徑表達(dá)纖維素酶,使酵母在擁有優(yōu)良產(chǎn)醇性能的同時,能直接利用木質(zhì)纖維素原料產(chǎn)醇,對能源結(jié)構(gòu)調(diào)整、環(huán)境保護(hù)等都具有重要意義。而此類酵母工程菌株的應(yīng)用,除了異源蛋白質(zhì)表達(dá)共性問題外,還面臨高底物濃度、高滲透壓、多種抑制物抑制等不利反應(yīng)條件;高濃度的乙酸、甲酸、糠醛和乙醇等組分都會降低酵母細(xì)胞活性和影響產(chǎn)醇性能。近年來新發(fā)現(xiàn)乙酸、乙醇等也能激活UPR信號通路:日本Nozomi Kawazoe等報道了>0.2%(v/v)醋酸脅迫處理誘導(dǎo)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯誤折疊蛋白的積累和Ire1p及Hac1p的活化;西班牙Elisabet NT等人則發(fā)現(xiàn)乙醇可以導(dǎo)致細(xì)胞膜的流動性改變,進(jìn)而激活UPR途徑。這些發(fā)現(xiàn)證明UPR途徑的激活不限于未折疊/錯誤折疊蛋白信號,也可以源自一些代謝途徑上的脅迫作用,從新的角度提示了酵母菌株自身抗不利因素脅迫能力在酵母異源蛋白表達(dá)容量進(jìn)而改造利用上的重要性和價值。
因此,酵母木質(zhì)纖維素產(chǎn)醇體系里的幾個關(guān)鍵要素—酵母細(xì)胞、異源蛋白及其表達(dá)和反應(yīng)理化因子,都存在UPR響應(yīng)問題。要實(shí)現(xiàn)高效的發(fā)酵產(chǎn)醇,僅僅關(guān)注其中一個要素是不夠的,各要素間的交互效應(yīng)和綜合作用更重要。而長期以來的相關(guān)研究則很少關(guān)注從UPR響應(yīng)和調(diào)控的角度去考察。要研究這些要素間在UPR響應(yīng)上的交互效應(yīng)和綜合作用,需要首先建立方便、快速、準(zhǔn)確檢測和量化UPR響應(yīng)的方法。本文報導(dǎo)了其中基于β-半乳糖苷酶Lac Z(β-galactosidase)的UPR響應(yīng)指示菌株的構(gòu)建,以及這些菌株對酸、醇及β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)表達(dá)的UPR響應(yīng)評價的初步結(jié)果。
相關(guān)新聞推薦
1、表達(dá)紅色熒光蛋白的重組鴨腸炎病毒一步生長曲線、穩(wěn)定性研究（一）
2、雞胸肉中耐多藥奇異變形桿菌噬菌體生長曲線、生物學(xué)特性分析（五）
3、厭氧血培養(yǎng)生長曲線異常，出現(xiàn)兩個生長周期【案例分析】