摘要：前期研究發(fā)現(xiàn)，隨著病毒的不斷傳代，插入到鴨腸炎病毒(DEV)UL2基因中的報告基因綠色熒光蛋白(GFP)會發(fā)生點突變或缺失，嚴重影響了重組DEV的反向篩選。為篩選更加穩(wěn)定的報告基因，通過酶切連接的方法以表達紅色熒光蛋白(RFP)的表達盒取代重組質(zhì)粒pT-UL2-GFP-gpt中的GFP-gpt表達盒，構(gòu)建表達RFP的UL2基因缺失轉(zhuǎn)移載體pT-UL2-RFP。該轉(zhuǎn)移載體與DEV共轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細胞(CEF)后，經(jīng)克隆純化獲得表達RFP的重組DEV。通過測定重組病毒及其親本毒的一步生長曲線及用PCR測定不同代次重組病毒的RFP序列發(fā)現(xiàn)，重組病毒在細胞和上清中的病毒含量分別在48 h和84 h達到峰值106.4 TCID50/0.1 mL和106.83 TCID50/0.1 mL，與親本毒無明顯差異(P>0.05);RFP表達盒在重組DEV連續(xù)傳12代后仍可穩(wěn)定表達，表明在DEV UL2區(qū)域插入RFP表達盒不影響病毒的繁殖，且RFP表達盒比GFP表達盒更適合作為報告基因。該研究結(jié)果對重組DEV的構(gòu)建、篩選具有重要意義。
鴨腸炎病毒(Duck enteritis virus，DEV)又稱鴨瘟病毒，可引起鴨病毒性腸炎，是一種泛嗜性全身性感染的病毒，也是危害養(yǎng)鴨業(yè)最為嚴重的病原之一。該病毒對不同品種、年齡的鴨均可致病?；疾▲喤R床表現(xiàn)為急性敗血癥過程，其特征是血管損傷，體腔溢血，消化道出血、炎癥和壞死等。
DEV屬于皰疹病毒科馬立克病毒屬，具有基因組大、非必需基因多、遺傳穩(wěn)定性好等特性。這些特性使DEV作為病毒載體成為可能。以DEV為載體，已成功表達了小鵝瘟病毒VP2基因、新城疫病毒F基因、H5N1型高致病性禽流感病毒HA基因。在DEV基因組中插入報告基因可快速高效地篩選重組病毒。目前常用綠色熒光蛋白(GFP)、增強型綠色熒光蛋白(EGFP)、紅色熒光蛋白(RFP)以及β-半乳糖苷酶基因(LacZ)標(biāo)記重組病毒。
孫瑩等通過同源重組將GFP表達盒插入DEV UL2基因，篩選并純化了表達綠色熒光蛋白的UL2基因缺失的重組DEV。但研究發(fā)現(xiàn)GFP在DEV中不能穩(wěn)定表達，隨著重組病毒的不斷傳代，GFP會發(fā)生點突變或缺失，因此有必要篩選更加穩(wěn)定的報告基團。
本研究將帶有RFP的UL2基因缺失轉(zhuǎn)移載體pT-UL2-RFP與DEV共轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細胞(Chicken embryo fibroblast，CEF)，經(jīng)過5輪蝕斑篩選、純化，獲得表達RFP的重組DEV，通過測定重組病毒及其親本毒的一步生長曲線以及用PCR測定不同代次重組病毒的RFP序列，以期獲得更穩(wěn)定的報告基因，為后期重組病毒的篩選奠定基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1試驗材料
1.1.1主要試劑
限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購自北京NEB公司；Ex Taq DNA聚合酶購自大連TaKaRa公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提中量試劑盒等均購自天根生化科技(北京)有限公司；胎牛血清、M199培養(yǎng)液購自Hyclone公司；OPTI-MEM培養(yǎng)液購自Gibco公司；7.5%NaHCO3購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司。
1.1.2菌(毒)株與細胞
DEV細胞適應(yīng)毒以及重組質(zhì)粒pT-UL2-GFP-gpt、pT-RFP由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種保藏與檢測室構(gòu)建、保存；DH5α受體菌購自天根生化科技(北京)有限公司。
1.1.3 SPF雞胚
購自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司。
1.1.4鑒定
引物ORFC17F：5’-ATGGCCGACG-ATAGGCT-3’，ORFC17R：5’-TTATACTGTTCCACAAGG-3’，由賽默飛世爾科技公司(Thermo Fisher Scientific)合成。
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