傷寒沙門菌是沙門菌屬中經(jīng)消化道感染人類的致病菌之一，可導致感染患者發(fā)生全身系統(tǒng)性感染，并能引發(fā)腸穿孔等嚴重的并發(fā)癥，進而危及感染患者的生命。傷寒沙門菌作為食源性致病菌，必須克服人體腸道內(nèi)的高滲應激環(huán)境才能最終致病。筆者在前期的研究工作中發(fā)現(xiàn)，在高滲應激環(huán)境下，傷寒沙門菌t4606基因的表達受到兩個重要的sigma因子，即RpoE和RpoS的雙重調控，提示t4606基因對傷寒沙門菌克服高滲應激環(huán)境極為重要。本研究利用原核生物基因敲除技術制備了傷寒沙門菌t4606基因缺陷株，并分析了其在高滲應激環(huán)境下的生物學特性，旨在通過分析t4606基因的功能，及其在沙門菌致病機制中的作用，為臨床治療和預防傷寒沙門菌感染提供可能的靶向基因。
1材料與方法
1.1菌株和質粒本試驗所采用的傷寒沙門菌、自殺質粒及大腸埃希菌（E.coli）DH5α菌株由本實驗室保存。
1.2試劑核酸限制性內(nèi)切酶BglⅡ、BamHⅠ及用于聚合酶鏈反應（PCR）的EXTaq酶購自寶生物工程（大連）有限公司；質粒提取試劑、膠回收試劑及T4DNA連接酶購自美國Promega公司。
1.3方法
1.3.1 t4606基因缺陷株的制備利用原核生物基因同源重組技術制備t4606缺陷變異株，篩選連續(xù)3次傳代均獲得穩(wěn)定重組的菌株作為t4606基因缺陷變異株，并采用序列分析進行驗證。相關引物見表1。
1.3.2 t4606基因缺陷株回補株的制備設計特異性引物擴增t4606基因全長，上、下游引物的5′端分別加入NcoⅠ、SalⅠ酶切位點（見表1），擴增獲得的全長片段經(jīng)酶切后與表達載體pBAD／gⅢ（阿拉伯糖操縱元）連接，克隆至E.coli DH5α感受態(tài)細胞，利用質粒的氨芐西林抗性初步篩選陽性重組質粒，篩選獲得的陽性重組質粒采用PCR及序列分析進行驗證（由上海生工生物技術公司完成）。培養(yǎng)經(jīng)驗證確定的陽性重組菌株，提取重組質粒pBADt4606，電擊導入t4606變異株，經(jīng)酶切及PCR驗證后命名為回補菌Δt4606（pBADt4606）。采用質量體積比（W／V）為0.2%的阿拉伯糖誘導質粒表達。
表1 PCR引物及序列
1.3.3生長曲線分析
基因缺陷株、缺陷回補株和野生株分別在37℃條件下，于LB培養(yǎng)液中振搖培養(yǎng)過夜；過夜培養(yǎng)后以1∶100的比例轉入新鮮、預熱的LB培養(yǎng)液，每隔1h檢測培養(yǎng)液在600nm處的吸光度值（A600值），以A600值為縱坐標，培養(yǎng)時間為橫坐標繪制生長曲線。用相同方法比較t4606缺陷株和野生株在高滲應激（300mmol／L NaCl）環(huán)境下的生存能力。每組實驗重復3次。于對數(shù)生長早期（培養(yǎng)4h）和對數(shù)生長晚期（12h）比較不同菌株培養(yǎng)液的A600值。
1.4統(tǒng)計學處理
采用SPSS13.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學分析。計量資料組間比較采用t檢驗；P＜0.05為比較差異有統(tǒng)計學意義。
2結果
2.1成功制備t4606基因缺陷株首先利用自殺質粒所具有的氨芐西林抗性，在含有氨芐西林的LB平板上篩選具有抗性的菌落，再進一步篩選耐蔗糖的菌落。以篩選獲得的陽性菌落DNA為模板，用t4606基因上、下游引物P1A和P2B進行PCR擴增，分析傷寒沙門菌t4606基因的重組變異情況。PCR擴增檢測相應菌落，直至篩選獲得連續(xù)傳代超過3次均僅有缺損片段的菌株。所獲得的菌株即為穩(wěn)定的t4606基因缺陷株。缺陷株及野生株PCR產(chǎn)物電泳結果見圖1。經(jīng)DNA序列分析，進一步證實702bp處被BglⅡ核酸限制性內(nèi)切酶的6個堿基酶切位點所替代。
圖1 t4606缺陷株及野生株PCR產(chǎn)物電泳圖
2.2成功構建
回補菌株Δt4606（pBADt4606）為進一步證實t4606基因的功能，利用表達載體pBAD／gⅢ將t4606基因回補引入t4606基因缺陷株，構建回補菌株Δt4606（pBADt4606）。利用質粒的氨芐西林抗性，初步篩選攜帶回補t4606基因質粒的細菌后，提取質粒，進行酶切及PCR驗證，酶切產(chǎn)物電泳結果見圖2。DNA序列分析證實堿基序列與實驗設計一致。
圖2回補t4606基因的鑒定
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