根據(jù)GenBanK中發(fā)表的多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，P.multocida）HN06株（登錄號為NC017027）的ompH核苷酸序列設(shè)計(jì)合成一對特異性引物，將PCR擴(kuò)增獲得的牦牛源P.multocida C47-8的ompH基因片段連接到pMR10載體上，構(gòu)建了C47-8株ΔompH缺失株互補(bǔ)質(zhì)粒pMR10-ΔompH，并將該質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至C47-8ΔompH缺失株中，成功獲得其互補(bǔ)菌株。在此基礎(chǔ)上，對C47-8親本株、ΔompH缺失株以及互補(bǔ)株的生物學(xué)特性進(jìn)行研究。形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果表明，3株菌的生長形態(tài)無差異；生化試驗(yàn)結(jié)果表明，除了缺失株發(fā)酵蕈糖、硝酸鹽試驗(yàn)呈現(xiàn)陽性外，3株菌的其余生化特性未發(fā)生改變；體外生長曲線表明親本株C47-8的生長速度比缺失株和互補(bǔ)株的生長速度慢，說明ompH基因?qū)47-8的生長有顯著影響。本試驗(yàn)為深入研究P.multocida的致病機(jī)制以及研制安全有效的基因缺失減毒活疫苗奠定了基礎(chǔ)。
體外生長曲線的測定3個(gè)菌株的OD600值，繪制細(xì)菌體外生長曲線，每個(gè)菌株做3個(gè)重復(fù)，用SPSS19.0軟件進(jìn)行分析，并根據(jù)生長曲線測定出細(xì)菌的代時(shí)。
體外生長曲線的測定將P.multocida菌液每隔1 h測定3次OD600值，將得到的數(shù)據(jù)用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并繪制體外生長曲線，結(jié)果見圖。
C47-8親本株、缺失株和互補(bǔ)株體外生長曲線的測定結(jié)果
從圖可知，親本株生長速度較慢，而缺失株和互補(bǔ)株則生長速度較快，由此可以確定ompH基因明顯影響了C47-8的生長。
2.3.4根據(jù)生長曲線測定出細(xì)菌的代時(shí)（G）C47-8親本株代時(shí)為1.248 h，缺失株為0.727 h，互補(bǔ)株為0.765 h。表明C47-8親本株代時(shí)最長，互補(bǔ)株居中，缺失株最快，說明ompH基因的缺失影響了P.multocida的生長。
討論
目前，青海省預(yù)防牦牛出血性敗血癥主要使用的是20世紀(jì)80年代從黃牛體中分離獲得的C45-2全菌滅活苗，但免疫效果差。隨著各種病原體反向遺傳操作技術(shù)體系的建立，越來越多的人將注意力轉(zhuǎn)移到了篩選與疾病流行相符合的地方血清型靶向缺失株，期望通過缺失關(guān)鍵的毒力相關(guān)基因，使毒力減弱，但保持免疫原性從而達(dá)到控制疾病的目的。
本研究前期選擇ompH基因作為缺失目標(biāo)，選用具有陽性Amp抗性基因和蔗糖陰性篩選基因sacB的pEX18AP質(zhì)粒為缺失載體，成功構(gòu)建了
3株無抗性基因標(biāo)記的P.multocida的ompH基因缺失株，構(gòu)建過程中沒有插入新的基因，避免了外源基因?qū)θ笔Ь甑母蓴_和潛在的生物安全危險(xiǎn)，為基因缺失疫苗的研究提供了可能。
本研究在對牦牛源P.multocida C47-8株外膜蛋白H基因的缺失株和互補(bǔ)株的形態(tài)學(xué)特性觀察研究中發(fā)現(xiàn)3個(gè)菌株菌落形態(tài)沒有發(fā)生改變，說明ompH不參與菌落形態(tài)的維持。生化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)C47-8缺失株發(fā)酵蕈糖，硝酸鹽試驗(yàn)呈陽性，與親本株和互補(bǔ)株不同，其原因可能是ompH蛋白對P.multocida起著負(fù)調(diào)控作用。該菌分解蕈糖可以為細(xì)菌在宿主細(xì)胞中的存活提供相應(yīng)的碳源和氮源，而ompH基因的缺失使P.multocida的轉(zhuǎn)錄不再受到抑制，為細(xì)菌供應(yīng)充足的碳源和氮源，以便細(xì)菌的大量繁殖。體外生長曲線表明缺失株和互補(bǔ)株的生長速度比親本株快，并且缺失株和互補(bǔ)株的菌體繁殖活力比親本株強(qiáng)，說明ompH基因?qū)47-8的生長有明顯影響，但是該基因具體通過什么方式和途徑影響菌體生長？其原因有待于進(jìn)一步研究。
ompH蛋白作為交叉保護(hù)的一種良好的候選抗原受到研究者們越來越多的關(guān)注。本試驗(yàn)構(gòu)建出的牦牛源P.multocida C47-8ΔompH互補(bǔ)株生物學(xué)特性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ompH基因的缺失導(dǎo)致產(chǎn)生了新的生物學(xué)表型，為下一步研制P.multocida基因缺失疫苗提供了重要的理論依據(jù)。
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