2.4.4致病菌生長與碳源的關(guān)系培養(yǎng)3 d后,菌落直徑與不同碳源的關(guān)系如圖8所示。
圖8不同碳源對菌落生長的影響
由圖8可以看出,在不加碳源以及以蔗糖、麥芽糖、淀粉、乳糖、葡萄糖為碳源時(shí),該菌均能生長,但是各實(shí)驗(yàn)組菌落直徑存在顯著差異。不加碳源的培養(yǎng)基菌落直徑增長最慢;以淀粉為碳源時(shí),菌落直徑與不加碳源組差異不顯著、與其他組有顯著性差異;以蔗糖和麥芽糖為碳源時(shí),兩組菌落直徑差異不顯著,菌落直徑相對較大,但與葡糖糖和乳糖為碳源時(shí)的菌落直徑有顯著差異,且比這兩組的菌落直徑要小;以葡萄糖和乳糖為碳源時(shí),兩組菌落直徑差異不顯著,但葡萄糖的菌落直徑明顯要比乳糖大。綜上,碳源對該致病菌生長有重要影響,在以葡萄糖為碳源時(shí)該菌長勢最好,而以蔗糖、乳糖、麥芽糖這些雙糖作為碳源時(shí)生長稍差,以淀粉為碳源時(shí)生長最差。
2.4.5菌絲生長與氮源的關(guān)系
相同的培養(yǎng)時(shí)間,菌落直徑與不同氮源的關(guān)系如圖9所示。
圖9不同氮源對菌落生長的影響
由圖9可以看出,不加氮源實(shí)驗(yàn)組以及以牛肉膏、蛋白胨、硫酸銨、硝酸鈉、硝酸鉀為氮源的實(shí)驗(yàn)組菌落均能生長,但是不加氮源組的菌落直徑明顯落后于加氮源組的,說明氮源為該菌生長的重要條件。從圖中可以看出,蛋白胨組、硫酸銨組、硝酸鉀組和硝酸鈉的菌絲直徑差異不顯著,但硫酸銨的菌落直徑>蛋白胨菌落菌落直徑,而以硫酸銨為氮源的菌落直徑明顯低于以硝酸鈉、硝酸鉀為氮源的實(shí)驗(yàn)組。綜上,氮源為該致病菌生長的重要影響因素,且以硝酸鈉、硝酸鉀為氮源時(shí),該菌生長最快,因此硝酸鈉、硝酸鉀類硝酸鹽類為該致病菌生長的最佳氮源。
2.5致病菌致死溫度區(qū)間的確定
分別經(jīng)35、40、45、50、55、60℃水浴20 min并振蕩培養(yǎng)72 h后,菌絲生長情況如圖10,回接后菌絲生長情況如圖11。
圖10不同溫度對菌落生長的影響
圖11 PDA回接實(shí)驗(yàn)結(jié)果
由圖10可知,分別經(jīng)35、40、45、50、55、60℃水浴20 min后,28℃對照組、35、40、45、50℃實(shí)驗(yàn)組均有菌絲生長且均形成了菌絲球,55、60℃的PDB培養(yǎng)液清澈,無菌絲生長。
取各試管中的培養(yǎng)液進(jìn)行PDA回接實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖11。經(jīng)28、35、40、45、50℃水浴20 min后回接在PDA培養(yǎng)基上,PDA培養(yǎng)基均有菌落生長,而經(jīng)55、60℃水浴20 min后回接在PDA培養(yǎng)基上,PDA培養(yǎng)基無菌落生長。由以上實(shí)驗(yàn)可知:該致病菌的致死溫度區(qū)間為50～55℃。
3討論與結(jié)論
本實(shí)驗(yàn)以山西榆次櫻桃園流膠樹體上分離純化得到的一株葡萄座腔菌為試驗(yàn)菌株,對其生物學(xué)特性進(jìn)行了試驗(yàn)研究。預(yù)實(shí)驗(yàn)階段將葡萄座腔菌分別接種于查氏培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基,結(jié)果發(fā)現(xiàn)PDA培養(yǎng)基更適合此菌生長;試驗(yàn)階段通過對菌絲結(jié)構(gòu)的觀察,發(fā)現(xiàn)該致病菌菌絲有明顯節(jié)狀結(jié)構(gòu),內(nèi)含橫膈膜,同時(shí)菌絲有樹狀分支,有些菌絲聯(lián)結(jié)成網(wǎng)狀。通過菌落劃傷、近紫外線照射及營養(yǎng)缺乏進(jìn)行誘導(dǎo)產(chǎn)孢試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),三種脅迫方式均能誘導(dǎo)其產(chǎn)生孢子,這一觀察與何靖柳等在觀察紅陽獼猴桃葡萄座腔菌時(shí)的結(jié)果相反,卻與韓青梅等在研究Botryosphaeriadothidea侵染蘋果果實(shí)的研究結(jié)果一致。
該葡萄座腔菌的孢子為卵形或橢圓形,大小不一,有聚集現(xiàn)象,與Phillips等對葡萄座腔菌孢子形態(tài)的描述一致。
研究最適生長條件的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,溫度、光照、pH、碳源、氮源均為葡萄座腔菌生長的重要影響條件。葡萄座腔菌最適溫度為28℃,有力說明了5～9月份為發(fā)病較為嚴(yán)重階段的原因。葡萄座腔菌最適光照條件為12 h光照/12 h黑暗交替。盧偉對桂花葉斑病病原葡萄座腔菌(B.dothidea)進(jìn)行生物學(xué)特性的研究試驗(yàn)也認(rèn)為病原菌生長的最適光照條件為交替光照,但羅光明等認(rèn)為光照對病原菌的生長無明顯影響。葡萄座腔菌最適生長pH為6.0,說明致病菌適生存于偏酸性環(huán)境。最適碳源為葡萄糖,最適氮源為硝酸鈉、硝酸鉀類硝酸鹽。該致病菌水浴處理20 min的致死溫度區(qū)間為50～55℃,這與黃靜等對侵染草莓的落葉松葡萄座腔菌的致死溫度70℃(20 min)不一致;這說明不同植株上分離的致病菌雖然同屬葡萄座腔菌,但生物學(xué)特性有所差異。這些結(jié)果表明即使是同類植物,分離得到的致病菌特性也不相同,因此對葡萄座腔菌應(yīng)該專株專治。
我國多樣的氣候及各種地理環(huán)境造就了豐富的葡萄座腔菌科真菌。本實(shí)驗(yàn)所用的葡萄座腔菌來自山西榆次櫻桃園流膠樹體,葡萄座腔菌是引起多種樹體流膠的病原菌之一,通過本實(shí)驗(yàn)對該致病菌生物學(xué)特性的研究結(jié)論,可以為其防治工作提供一定的理論基礎(chǔ):調(diào)節(jié)櫻桃樹的栽種溫度,栽種土壤中性偏堿,避免硝酸類肥料,在櫻桃樹生長過程中要保護(hù)樹體,避免讓樹體出現(xiàn)傷口,減少紫外線照射,盡可能破壞致病菌生長的最佳條件,抑制葡萄座腔菌的生長,從而降低甜櫻桃流膠病的發(fā)病率,增加甜櫻桃產(chǎn)量。
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