來自山東大學(xué)齊魯醫(yī)院的研究團(tuán)隊在《Advanced Biology》發(fā)表的最新研究揭示了腸道微生物群與克羅恩?。–D）之間的緊密聯(lián)系及獨特作用機(jī)制。這一發(fā)現(xiàn)挑戰(zhàn)了傳統(tǒng)對CD發(fā)病機(jī)制的認(rèn)知，首次證實可從RNA-seq數(shù)據(jù)中同時恢復(fù)宿主基因表達(dá)和微生物定量信息，明確了微生物組成變化與宿主基因表達(dá)異常的潛在因果關(guān)系。研究不僅為理解腸道微生物與宿主免疫的相互作用提供了新視角，還為開發(fā)基于微生物的CD診斷方法和靶向治療策略奠定了理論基礎(chǔ)。
研究背景
在克羅恩?。–D）的診療過程中，明確發(fā)病機(jī)制并實現(xiàn)精準(zhǔn)診斷始終是關(guān)鍵難題。腸道微生物失調(diào)與宿主基因表達(dá)異常在CD的發(fā)展中起著重要作用，然而，二者之間的因果關(guān)系一直難以明確?，F(xiàn)有研究大多聚焦于糞便微生物，對組織駐留微生物的了解有限，且缺乏能夠同時獲取微生物定量和宿主基因表達(dá)數(shù)據(jù)的有效方法。傳統(tǒng)的診斷模型大多依賴宿主基因，容易受到技術(shù)偏差和批次效應(yīng)的影響，難以實現(xiàn)精準(zhǔn)診斷。
轉(zhuǎn)錄組分析宿主-微生物相互作用（TAHMC）技術(shù)，作為一種新興的研究手段，具備從批量RNA-seq數(shù)據(jù)中同時恢復(fù)宿主基因表達(dá)和微生物定量信息的潛力。但此前該技術(shù)在克羅恩病研究中的應(yīng)用較少，其在揭示腸道微生物與宿主基因表達(dá)關(guān)系方面的能力尚未得到充分挖掘。部分研究對其數(shù)據(jù)處理和分析方法存在質(zhì)疑，認(rèn)為可能存在誤差影響研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。研究團(tuán)隊以探究克羅恩病中組織駐留微生物與宿主基因的關(guān)聯(lián)為目標(biāo)，試圖借助TAHMC技術(shù)解開這一謎團(tuán)。
主要結(jié)果
1.TAHMC技術(shù)對腸道微生物群的精準(zhǔn)解析與污染過濾驗證
為明確克羅恩?。–D）黏膜組織微生物組成及排除數(shù)據(jù)污染干擾，研究團(tuán)隊利用TAHMC技術(shù)對1855例RNA-seq樣本（1554例CD、301例對照）進(jìn)行深度分析。通過五步過濾法（批次、相關(guān)性、豐度、黑名單及文獻(xiàn)校驗）去除污染物，最終獲得692個屬的黏膜共生微生物數(shù)據(jù)（47794497條reads），其中變形菌門污染物占比最高（554個屬），驗證了污染過濾的必要性。
對比CD與對照組發(fā)現(xiàn)，CD組微生物α多樣性（Shannon/Simpson指數(shù)）顯著降低，β多樣性分析（PCoA）顯示兩組微生物組成存在顯著差異（PERMANOVA,P<0.0001）。門水平上，CD組擬桿菌門、放線菌門豐度升高，厚壁菌門降低；屬水平鑒定出108個差異菌屬（91個減少，17個增加），包括已知IBD相關(guān)菌屬如Akkermansia、Faecalibacterium，及潛在新關(guān)聯(lián)菌屬。FISH實驗證實CD回腸組織中細(xì)菌主要定位于細(xì)胞內(nèi)，揭示組織駐留微生物的獨特分布特征。
圖1涵蓋TAHMC流程、污染過濾結(jié)果及FISH驗證細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌存在的TAHMC技術(shù)解析腸道微生物組成及分布
圖2克羅恩病與對照組腸道微生物群差異分析
2.免疫浸潤亞型鑒定及其與微生物群的關(guān)聯(lián)性分析
為揭示CD免疫微環(huán)境異質(zhì)性及微生物群對免疫狀態(tài)的影響，篩選與臨床表型相關(guān)的關(guān)鍵免疫亞型，研究基于MCPcounter算法評估免疫細(xì)胞浸潤，通過共識聚類劃分免疫亞型，并結(jié)合抗TNF耐藥基因集及微生物差異分析（MaAsLin2、LEfSe）。研究將CD樣本分為兩種免疫浸潤亞型（C1/C2）。C2亞型整體免疫細(xì)胞浸潤水平顯著高于C1（P<0.001），且富集抗原呈遞、促炎信號相關(guān)基因（如CXCL1、CCL2），提示過度免疫激活狀態(tài)。進(jìn)一步結(jié)合抗TNF耐藥基因集分析，發(fā)現(xiàn)C2亞型耐藥基因表達(dá)顯著升高（P<0.01），且患者診斷年齡更早（P<0.05），提示更差的臨床表型。
微生物群與免疫亞型關(guān)聯(lián)分析顯示，C2亞型中Edwardsiella、Nocardia等3個菌屬富集，而C1亞型富集38個菌屬（如Dorea、Alistipes），其中16個屬在對照組中高豐度。α/β多樣性分析表明，C1/C2亞型微生物群落結(jié)構(gòu)差異顯著（P<0.05），且Lachnospiraceae家族豐度與免疫激活基因呈負(fù)相關(guān)（Spearman R<?0.3,P<0.05），揭示特定微生物通過調(diào)控免疫通路影響CD進(jìn)展。
圖3克羅恩病免疫浸潤亞型鑒定及臨床關(guān)聯(lián)，呈現(xiàn)免疫亞型分類、免疫細(xì)胞浸潤差異及抗TNF耐藥性/診斷年齡關(guān)聯(lián)
圖4腸道微生物群與宿主免疫浸潤關(guān)聯(lián)分析，揭示微生物聚類與免疫亞型的相關(guān)性、差異菌屬分布及功能通路聯(lián)系
3.基因-微生物關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及診斷
模型開發(fā)為挖掘微生物與宿主基因的互作機(jī)制，構(gòu)建基于微生物-基因網(wǎng)絡(luò)的CD診斷模型，研究利用lasso回歸結(jié)合穩(wěn)定性選擇，分別構(gòu)建對照組與CD組的mRNA/lncRNA-微生物關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。發(fā)現(xiàn)CD組微生物與宿主基因的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度顯著高于對照組（正相關(guān)邊：CD組1075條vs對照組615條）。篩選差異表達(dá)基因（DEGs）與差異微生物（DAMs）的核心互作節(jié)點，構(gòu)建包含11個微生物屬（如Faecalibacterium、Akkermansia）和12個宿主基因（如CXCL1、BIRC3）的Host-Microbe Network Signatures（HMNSig）。
機(jī)器學(xué)習(xí)模型驗證顯示，HMNSig在獨立測試集（ICDR隊列，n=483）中診斷效能優(yōu)異，AUC達(dá)0.77（95%CI:0.73–0.82），顯著優(yōu)于單一宿主基因或微生物模型（P<0.05）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，模型核心基因富集于免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞黏附通路，而核心菌屬多與腸道屏障功能相關(guān)，提示微生物-基因互作通過多通路影響CD發(fā)病。
圖5基因-微生物關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及診斷效能驗證
4.體外實驗驗證微生物對宿主基因的調(diào)控作用
針對實驗3中關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵菌屬Faecalibacterium prausnitzii（CD組豐度顯著降低），通過Caco-2細(xì)胞共培養(yǎng)實驗驗證其對宿主基因的調(diào)控效應(yīng)。轉(zhuǎn)錄組分析顯示，共培養(yǎng)后44個基因顯著上調(diào)（如CXCL1、CCL20，P<0.01），主要涉及趨化因子信號與炎癥反應(yīng)。Spearman相關(guān)性分析表明，F(xiàn).prausnitzii豐度與上述基因表達(dá)呈正相關(guān)（R=0.28–0.32,P<1×10??），與體外實驗結(jié)果一致。
活/死細(xì)胞染色及細(xì)胞膜完整性檢測顯示，共培養(yǎng)后細(xì)胞凋亡率無顯著變化（P*>0.05），提示F.prausnitzii通過非細(xì)胞毒性機(jī)制調(diào)控基因表達(dá)，可能與代謝產(chǎn)物介導(dǎo)的信號通路激活相關(guān)。該結(jié)果為“微生物通過宿主轉(zhuǎn)錄調(diào)控參與CD發(fā)病”提供了直接實驗證據(jù)，支持TAHMC預(yù)測的微生物-基因互作網(wǎng)絡(luò)的可靠性。
圖6 Faecalibacterium prausnitzii調(diào)控宿主基因的體外驗證
結(jié)論本研究通過TAHMC技術(shù)開發(fā)、微生物群深度解析、免疫浸潤分型及機(jī)器學(xué)習(xí)建模等多維度研究設(shè)計，系統(tǒng)揭示了克羅恩?。–D）中腸道微生物群與宿主基因表達(dá)的互作機(jī)制及其臨床價值。研究以CD回腸組織RNA-seq數(shù)據(jù)為核心，結(jié)合熒光原位雜交（FISH）、單細(xì)胞測序及體外共培養(yǎng)實驗，證實TAHMC技術(shù)可從復(fù)雜數(shù)據(jù)中精準(zhǔn)恢復(fù)微生物定量與宿主轉(zhuǎn)錄信息，發(fā)現(xiàn)CD黏膜組織微生物α多樣性顯著降低、關(guān)鍵菌屬（如厚壁菌門減少、擬桿菌門增加）與免疫浸潤亞型（C1/C2）密切相關(guān)，且微生物-基因關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)在CD組中呈現(xiàn)更強(qiáng)的互作信號。研究首次闡明，CD中組織駐留微生物通過調(diào)控宿主免疫通路（如趨化因子信號、炎癥反應(yīng)基因）參與疾病進(jìn)展，且這種互作可通過機(jī)器學(xué)習(xí)轉(zhuǎn)化為高效診斷模型——包含11個微生物屬與12個宿主基因的HMNSig模型在獨立隊列中診斷AUC達(dá)0.77，突破了傳統(tǒng)依賴單一宿主基因的診斷局限。
體外實驗進(jìn)一步驗證，關(guān)鍵菌屬Faecalibacterium prausnitzii通過非細(xì)胞毒性機(jī)制上調(diào)宿主免疫調(diào)節(jié)基因（如CXCL1、CCL20），揭示微生物-基因互作的直接功能關(guān)聯(lián)。該研究不僅證實了TAHMC技術(shù)在解析微生物-宿主互作中的獨特優(yōu)勢，更首次建立了從黏膜微生物組成到宿主基因表達(dá)異常的因果鏈條，為理解CD發(fā)病機(jī)制提供了“微生物-免疫-基因”三軸聯(lián)動的新視角。其發(fā)現(xiàn)的天然抑菌機(jī)制（對應(yīng)絲素蛋白研究中的天然屬性）轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用潛力——基于微生物-基因網(wǎng)絡(luò)的精準(zhǔn)診斷模型、靶向關(guān)鍵菌屬的免疫調(diào)節(jié)療法，為開發(fā)無化學(xué)干預(yù)、聚焦宿主-微生物穩(wěn)態(tài)的新型CD治療策略開辟了創(chuàng)新路徑，尤其在精準(zhǔn)醫(yī)療時代展現(xiàn)出通過調(diào)節(jié)微生物-基因互作實現(xiàn)個體化診療的廣闊前景。
相關(guān)新聞推薦
1、土壤有機(jī)磷源卵磷脂和植酸對禾谷鐮刀菌菌絲生長和致病力的影響（二）
2、臭鱖魚中優(yōu)良乳酸菌的分離篩選、生長曲線及耐溫性試驗（一）