能夠分解果膠質(zhì)的酶稱作果膠酶（pectinase）.該酶可分為：原果膠酶、裂解酶（PL）、多聚半乳糖醛酸酶（PG）和果膠酯酶（PE）.相應(yīng)地，測(cè)量酶活性的方法也有很多，如滴定法、黏度下降法、脫膠作用時(shí)間法、還原糖測(cè)定法、紫外吸收測(cè)定法等。本實(shí)驗(yàn)酶活性測(cè)定均采用還原糖測(cè)定法中的3,5-二硝基水楊酸（DNS）法.
果膠酶主要應(yīng)用于食品加工業(yè)，在紡織、環(huán)境保護(hù)、飼料加工、生物制漿、木材防腐等行業(yè)中也有廣泛的應(yīng)用，草酸青霉（Penicillium oxalicum）果膠酶的誘導(dǎo)抗病作用。
果膠酶主要由微生物和植物合成。微生物中的真菌、放線菌和細(xì)菌都能產(chǎn)生果膠酶的相關(guān)酶系。目前國(guó)內(nèi)外研究與應(yīng)用較多的是細(xì)菌和霉菌，其中黑曲霉（Asperillus niger）是國(guó)際公認(rèn)的安全菌株，所以最受關(guān)注.此外，酵母菌、鏈霉菌和根霉等也有相關(guān)的報(bào)道，而關(guān)于草酸青霉（Penicillium oxalicum）的相關(guān)報(bào)道甚少，草酸青霉（Penicillium oxalicum）產(chǎn)果膠酶的液體發(fā)酵更是鮮有報(bào)道。
果膠酶的傳統(tǒng)工業(yè)化生產(chǎn)主要采用固體發(fā)酵法，但液體發(fā)酵法具有發(fā)酵條件參數(shù)易于測(cè)量、再現(xiàn)性強(qiáng)、易于控制等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)從污泥中篩選到一株高產(chǎn)果膠酶的草酸青霉，運(yùn)用液體發(fā)酵法對(duì)其酶活性進(jìn)行了相關(guān)研究。
1材料和方法
1.1菌株來源
以從山東、四川、海南、浙江等地采集的土壤、昆蟲、動(dòng)物內(nèi)臟、腐爛水果等100多份樣品為材料，分離篩選獲得高產(chǎn)果膠酶菌株。
1.2培養(yǎng)基
1）馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂15——20 g,水1000 mL,pH 6.0.
2）產(chǎn)果膠酶篩選培養(yǎng)基：果膠30 g,NaNO33 g,K2HPO4·3H2O 3.3 g,KCl 0.5 g,Fe2（SO4）30.01 g,（NH4）2SO420 g,MgSO40.24 g,CaCl20.15 g,KH2PO43.8 g,瓊脂粉20 g,溴酚藍(lán)0.2 g,水1000 mL,pH 6.0.
3）搖瓶種子培養(yǎng)基：果膠4 g,（NH4）2SO41 g,KH2PO43.8 g,K2HPO4·3H2O 0.2 g,水100 mL,pH 6.0.
4）搖瓶基礎(chǔ)培養(yǎng)基：桔皮粉4 g,米糠4 g,（NH4）2SO41 g,KH2PO43.8 g,K2HPO4·3H2O 0.2 g,水100 mL,pH 6.0.
1.3初篩
取適量土樣、昆蟲、腐爛果實(shí)等磨碎后加無菌水，于28℃培養(yǎng)24 h,然后取0.1 mL培養(yǎng)液進(jìn)行涂布，培養(yǎng)3 d.產(chǎn)果膠酶的菌落著生的藍(lán)色培養(yǎng)基有黃色水解圈生成，挑取水解圈明顯的菌落進(jìn)行復(fù)篩【10].
1.4復(fù)篩
在篩選培養(yǎng)基中挑取水解圈大的單菌落，通過測(cè)定和計(jì)算其變色圈直徑和菌落生長(zhǎng)圈直徑的比值（Dp/Dc）進(jìn)行復(fù)篩。在培養(yǎng)皿的中心分別接入初篩獲得的菌種，接種后培養(yǎng)皿置28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d.測(cè)量各菌落生長(zhǎng)圈的直徑Dc和變色圈的直徑Dp,選擇Dp/Dc值較大的菌種備用，最終選取一株果膠酶活性高的菌株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
1.5搖瓶培養(yǎng)
將復(fù)篩獲得的菌種經(jīng)PDA斜面培養(yǎng)后，用無菌水配成1.0×106的孢子懸浮液，取2 mL（搖瓶裝液量的5%）接入種子搖瓶培養(yǎng)基中，回轉(zhuǎn)式搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min,28℃培養(yǎng)24 h后，取3.2 mL（搖瓶裝液量的8%）種子液接入搖瓶培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)70 h.搖瓶裝液量均為250 mL三角瓶中裝40 mL.
1.6粗酶液的提取
發(fā)酵液在4℃，10000 r/min離心10 min,取上清液作為粗酶液。
1.7酶活性測(cè)定
采用3,5-二硝基水楊酸（DNS）法【3]測(cè)定酶活性。吸取0.2 mL適當(dāng)稀釋的酶液于試管中，加1.8 mL 0.4%的果膠底物溶液，50℃水浴反應(yīng)30 min后，加2 mL DNS試劑終止反應(yīng)，沸水浴10 min,冷卻后蒸餾水定容到15 mL,搖勻?？瞻讓?duì)照：吸取0.2 mL煮沸的稀釋酶液于試管中，加2 mL DNS試劑和1.8 mL 0.4%的果膠底物溶液，50℃水浴反應(yīng)30 min,沸水浴10 min,冷卻后蒸餾水定容到15 mL,搖勻。在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。在上述反應(yīng)體系中，以每毫升果膠酶液降解果膠底物1 min產(chǎn)生1μg還原糖定義為1個(gè)酶活性單位。
1.8培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)果膠酶的影響
取3.2 mL（搖瓶裝液量的8%）種子液接入40個(gè)250 mL裝液量為40 mL的三角瓶?jī)?nèi)，160 r/min,28℃搖瓶培養(yǎng)，每隔2 h取樣。接著，將菌體一并用濾紙過濾，然后用烘箱于50℃烘至恒重，再用分析天平稱菌絲體干質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
1.9菌種鑒定
1.9.1培養(yǎng)和形態(tài)特征觀察
將菌株在PDA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)3 d,用顯微鏡觀察其菌絲、分生孢子梗、分生孢子等特征。
1.9.2 DNA提取與ITS序列分析
取PDA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)3 d的新鮮菌絲體50 mg,加液氮研磨成粉末，用試劑盒提取DNA.利用真菌通用引物ITS1:5‘-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和ITS4:5‘-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’進(jìn)行rDNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列擴(kuò)增，測(cè)序由上海生物工程有限公司完成。將測(cè)得的ITS序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，通過同源性分析對(duì)菌株進(jìn)行分子水平的鑒定。
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