鐵是生命體必需的一種營養(yǎng)元素，它可以參與眾多的生物代謝過程，如光合作用、呼吸作用、氮的固定和DNA的生物合成等。鐵是地殼中含量最多的一種過渡金屬元素，它存在著還原型Fe2+和氧化型Fe3+兩種可以可逆變化的化合態(tài)，在自然界的有氧條件下鐵主要以三價(jià)的氧化物或氫氧化物的形式存在，其溶解性極低、生物可利用性低，游離Fe3+的濃度一般不超過10-18M。為了適應(yīng)在低鐵的限制性環(huán)境中生長代謝對(duì)鐵的需要，微生物發(fā)展了多種鐵吸收系統(tǒng)來從環(huán)境中攝取鐵。
主要包括合成和利用鐵載體，還原三價(jià)鐵為生物利用性更高的亞鐵形式并吸收，降低環(huán)境pH值來增加鐵的溶解性，利用宿主的鐵蛋白，如乳鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白等。合成和利用鐵載體是微生物鐵代謝的一種主要途徑。鐵載體是微生物在低鐵的限制性條件的誘導(dǎo)下合成的一類低分子量化合物，對(duì)Fe3+有特異的高親和力，在微生物界分布廣泛，種類多樣，生物活性多樣。絕大多數(shù)微生物都可以合成鐵載體，依據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)不同可基本分為三類：氧肟酸鹽型、兒茶酚鹽型和多羥基羧酸類。細(xì)菌中各種類型的鐵載體都可以產(chǎn)生，而真菌只合成氧肟酸鹽型鐵載體。某些病原微生物的鐵載體與它們的毒力有關(guān)，因?yàn)閺乃拗黧w內(nèi)吸收鐵是病原菌繁殖和感染的必要步驟。此外，鐵載體在病原微生物的控制方面也扮演著重要的角色，由于鐵的螯合作用可以抑制病原菌對(duì)鐵的利用，從而抑制病原菌的生長和代謝活性。由于人體細(xì)胞沒有鐵載體合成的相關(guān)途徑，所以它們的生物合成和吸收途徑還可以應(yīng)用于抗微生物治療。除此之外，F(xiàn)e2+還可以與超氧陰離子、過氧化氫等氧化因子反應(yīng)生成反應(yīng)性更強(qiáng)的羥基自由基。羥基自由基是一種極強(qiáng)的氧化劑，它可以無選擇性的破壞幾乎所有的生物分子，包括糖、脂、DNA鏈等，對(duì)細(xì)胞具有極大的損害效應(yīng)。
因此，好氧和兼性厭氧微生物面臨一種兩難的境地：一方面微生物細(xì)胞必須利用有效的鐵吸收機(jī)制來從環(huán)境中吸收鐵以供其生長代謝的需要，另一方面又要嚴(yán)格控制細(xì)胞內(nèi)游離鐵的濃度，使細(xì)胞內(nèi)催化性鐵的濃度維持在無害的水平。對(duì)鐵和鐵載體的研究有助于闡明微生物鐵代謝的途徑、機(jī)理等問題，對(duì)醫(yī)學(xué)、工業(yè)、農(nóng)業(yè)和環(huán)境都有重要的應(yīng)用價(jià)值。論文通過對(duì)27株絲狀真菌鐵載體合成情況的比較研究，從中篩選到Aspergillus niger An76菌株作為生產(chǎn)菌株。對(duì)其在低鐵的培養(yǎng)條件下合成的鐵載體進(jìn)行分離純化，理化性質(zhì)測定，并對(duì)該鐵載體的細(xì)菌抑制活性進(jìn)行了較深入的研究。同時(shí)對(duì)高濃度的Fe3+的抑菌活性和作用機(jī)理進(jìn)行了探索研究。
論文取得了如下創(chuàng)新性的結(jié)果：
1.篩選到一株高產(chǎn)鐵載體的菌株A.niger An76，其鐵載體在濃度高達(dá)1 mM Fe3+的培養(yǎng)條件下仍然能夠合成，為組成型表達(dá)。An76鐵載體與典型的氧肟酸鹽型和兒茶酚鹽型鐵載體不同，它具有羥基羧酸鹽型鐵載體的特性，為一種新的鐵載體。它不含氨基酸成分，并且具有羥基自由基清除活性。An76鐵載體具有顯著的抑菌活性，這為篩選新的抗生素藥物提供了新途徑。采用2D/3D作圖法表征實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的方法可用于研究藥物的抗菌機(jī)理。
2.研究發(fā)現(xiàn)供試的G+/G細(xì)菌都可以吸附Fe3+，并可以迅速的將Fe3+還原為Fe2+。高濃度的Fe3+對(duì)細(xì)菌生長有顯著的抑制作用，推測Fe3+對(duì)細(xì)菌的抑制作用是通過Fe2+催化羥基自由基的形成從而抑制細(xì)菌生長的。不同的鐵載體對(duì)Fe3+的抑菌活性具有不同的影響，這為發(fā)展新的抗菌劑提供了線索。
一、鐵載體生產(chǎn)菌的篩選、鐵載體的分離純化和性質(zhì)鑒定，以及鐵載體的細(xì)菌抑制活性。
通過對(duì)27株絲狀真菌在三種不同培養(yǎng)基條件下的鐵載體生產(chǎn)情況進(jìn)行比較研究，我們發(fā)現(xiàn)Aspergillus niger An76鐵載體合成能力的表達(dá)在濃度高達(dá)1 mMFe3+的培養(yǎng)條件下仍然不受抑制，表明它的鐵載體合成不是低鐵的限制性條件誘導(dǎo)表達(dá)的，而是組成型表達(dá)。然而其它的大多數(shù)供試真菌的鐵載體合成在Fe3+濃度達(dá)到20μM時(shí)就會(huì)受到抑制。低濃度的鐵更有利于鐵載體的合成。對(duì)A.niger An76在低鐵的限制性條件下培養(yǎng)所產(chǎn)生的鐵載體進(jìn)行分離純化，通過大量的探索性試驗(yàn)，確定了一可以將其部分純化的分離方案。采用該方案可以在較短時(shí)間內(nèi)制備足夠量的樣品來研究其理化性質(zhì)和細(xì)菌抑制活性。
通過超濾、真空冷凍干燥得到粗樣品，采用醋酸鉛沉淀法進(jìn)行初步的分離，經(jīng)過CMFast Flow離子交換層析得到較好的分離效果，如圖1所示，Peak 1為鐵載體活性峰。經(jīng)過離子交換層析得到的活性樣品進(jìn)一步采用TSK-GEL G2500PW液相色譜柱進(jìn)行分離，結(jié)果如圖2所示，Peak 4為活性峰。圖1Aspergillus niger An76鐵載體CM Fast Flow離子交換層析圖譜圖2經(jīng)離子交換層析所得活性樣品TSK-GEL G2500PW分離圖譜采用Arnow法和Csaky法對(duì)An76鐵載體進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示它既不是兒茶酚鹽也不是氧肟酸鹽。An76鐵載體與銅離子形成的絡(luò)合物在250.50 nm有紫外吸收，具有羥基羧酸鹽型鐵載體的性質(zhì)，為一種新的鐵載體?？捡R斯亮藍(lán)染色、茚三酮試驗(yàn)和雙縮脲試驗(yàn)，以及氨基酸組成分析結(jié)果顯示它不含氨基酸成分。同時(shí)試驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)An76鐵載體具有高的極性、高的熱穩(wěn)定性。鐵還原試驗(yàn)表明An76鐵載體具有還原Fe3+能力，可以將Fe3+還原成溶解性、生物可利用性更高Fe2+，這為滿足A.niger An76在低鐵的限制性環(huán)境下生長代謝對(duì)鐵的需求提供了有力的保障。
通過硫代巴比妥酸(TBA)法和電子自旋共振(ESR)譜測定，發(fā)現(xiàn)An76鐵載體具有顯著的羥基自由基清除活性。如圖3所示，DMPO-HO信號(hào)隨著An76鐵載體濃度的增加而減弱。這為發(fā)展新的抗氧化劑、自由基清除劑提供了新的選擇。圖3Aspergillus niger An76鐵載體羥基自由基清除活性電子自旋共振檢測結(jié)果通過對(duì)32株G+/G-細(xì)菌，包括植物病原菌、動(dòng)物病原菌和人類病原菌的研究，發(fā)現(xiàn)An76鐵載體具有廣譜的細(xì)菌生長抑制活性，其抑菌活性隨鐵載體濃度的增加而增強(qiáng)，并隨時(shí)間的延長成指數(shù)性增加。這為發(fā)展新的抗菌藥物提供了新的選擇。酸性pH條件是它發(fā)揮抑菌活性所必須依賴的。采用Spline-Numerical-Gaussian(SNG)方法，對(duì)兩株植物病原細(xì)菌Pseudomonas solanacearum和Ralstonia solanacearum在分批培養(yǎng)條件下的生長階段進(jìn)行劃分。研究了An76鐵載體在不同濃度和不同處理時(shí)間下，對(duì)處于不同生理時(shí)期的菌群存活率的影響。提出了采用二維等高線圖和三維圖譜來對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析的新方法。常規(guī)的動(dòng)力學(xué)表征方法對(duì)不同藥物濃度、不同處理時(shí)間條件下的結(jié)果的動(dòng)態(tài)過程難以表征。
利用二維、三維圖形就可以把這一復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過程表征出來。它所顯示的雖然僅是相對(duì)值，但對(duì)反應(yīng)趨勢、范圍都可以清楚的顯示出來，而且由三維圖的曲線下總面積AUC(Area Under Curve)還可以做定量估算，而這些信息都是現(xiàn)在已有方法不能提供的，也表明了現(xiàn)在通用的藥效檢測方法存在的問題。2D/3D作圖法對(duì)應(yīng)用研究中分析藥物抑菌/殺菌機(jī)理和確定用藥方式等都會(huì)有重要的意義。圖4、5、6分別用常規(guī)動(dòng)力學(xué)曲線、二維和三維圖譜顯示了不同濃度An76鐵載體對(duì)處于4個(gè)不同生理時(shí)期的P.solanacearum的抑制作用結(jié)果。圖4鐵載體濃度和菌群生長期對(duì)Pseudomonas solanacearum生長的影響(以CFU%表示)圖5鐵載體濃度和菌群生長期對(duì)Pseudomonas solanacearum生長的影響(以CFU%二維等高線圖表示)圖6鐵載體濃度和菌群生長期對(duì)Pseudomonas solanacearum生長的影響(以CFU%三維圖表示)
二、細(xì)菌對(duì)Fe3+的吸附還原作用，以及Fe3+對(duì)細(xì)菌生長的抑制作用。
通過對(duì)20株G+/G-細(xì)菌，包括植物病原菌和動(dòng)物病原菌的研究，發(fā)現(xiàn)高濃度的Fe3+對(duì)細(xì)菌具有明顯的抑制作用，這是一種普適性的抑菌能力。從中挑選出4株典型的細(xì)菌，2株G-細(xì)菌Escherichia coli CVCC 249和Ralstonia solanacearum和2株G+細(xì)菌Staphyloccocus aureus ATCC 25923和Bacillus subtilis，研究了它們對(duì)Fe3+的吸附還原作用，以及Fe3+對(duì)它們生長的抑制效應(yīng)，初步分析了Fe3+的抑菌機(jī)理。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌菌體對(duì)Fe3+有明顯的吸附作用，同時(shí)可以迅速的將Fe3+還原為Fe2+。高濃度Fe3+對(duì)細(xì)菌具有顯著的抑制作用，并且抑制效果與Fe3+濃度成正相關(guān)。4株細(xì)菌對(duì)Fe3+的敏感性不同，但抑菌動(dòng)力學(xué)曲線相同，表明Fe3+對(duì)細(xì)菌的抑制作用是一非選擇性的作用機(jī)制。鐵載體可以和Fe3+形成絡(luò)合物，對(duì)Fe3+的抑菌活性有不同的影響，acetohydroxamic acid和2，3-dihydroxybenzoic acid與Fe3+形成的絡(luò)合物可以催化羥基自由基的產(chǎn)生，增加Fe3+的抑菌作用。A.niger An76鐵載體由于它具有羥基自由基清除活性，可以降低Fe3+的抑菌作用。推測Fe3。對(duì)細(xì)菌的抑制作用是通過羥基自由基的形成而起作用的。這為利用鐵和鐵載體生產(chǎn)新型抗菌劑提供了線索。
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