馬腺疫（strangles）是由馬鏈球菌馬亞種（Streptococcus equisubsp.equi，SEE）引起的一種以發(fā)熱、精神沉郁、頜下及咽喉淋巴結(jié)膿腫等的臨床癥狀[1]，且具有種屬特異性的急性上呼吸道傳染病，是最常見的馬屬動物的傳染病之一[2-3]。馬鏈球菌馬亞種為鏈球菌屬C群成員，革蘭氏陽性，β溶血性鏈球菌，毒力基因包括透明質(zhì)酸、肽聚糖、鏈球菌溶血素S等[4-6]，其中SeM蛋白是馬鏈球菌馬亞種重要的毒力因子，是細(xì)菌逃避吞噬作用和宿主免疫的重要保護性抗原，特異性高且高度保守，常被用來鑒定馬鏈球菌馬亞種[7-10]。
科學(xué)養(yǎng)殖、安全防控知識的缺乏導(dǎo)致驢感染馬鏈球菌馬亞種的病例時有發(fā)生[11]?，F(xiàn)代規(guī)模化驢場對于疫病的防控除了對病原體檢測和發(fā)病動物隔離治療等措施外，場區(qū)內(nèi)外的環(huán)境消毒及進出人員和動物的消毒是防控疫病發(fā)生最主要的措施之一[12]。消毒劑按殺菌效果分為高效消毒劑、中效消毒劑和低效消毒劑[13]。高效消毒劑包括鹵素類消毒劑、氧化劑類消毒劑、醛類消毒劑；中效消毒劑包括含碘消毒劑、醇類消毒劑、酚類消毒劑；低效消毒劑包括季銨鹽類消毒劑[14]。高效消毒劑可殺滅各類微生物，包含其芽孢；中效消毒劑可殺滅細(xì)菌繁殖體以及多數(shù)病毒和真菌；低效消毒劑可殺滅親脂性病毒以及細(xì)菌繁殖體[15]。消毒劑的種類不同，殺菌機制也復(fù)雜多樣。如何科學(xué)選擇、使用消毒劑對于疫病防控極為重要。
2019年4月新疆石河子地區(qū)驢場發(fā)生一起疑似馬腺疫疫情，為明確病原，了解驢源馬鏈球菌馬亞種的環(huán)境適應(yīng)性及對消毒劑的敏感性。本研究對石河子地區(qū)發(fā)病驢場病原菌進行分離鑒定，并對分離株在不同培養(yǎng)條件下的生長特性及常用消毒劑的敏感性進行測定，以期對規(guī)?；H場防控馬腺疫提供參考。
1材料與方法
1.1病料來源
新疆石河子某驢場臨床感染的驢及死亡驢頜下膿汁6份、肺部膿汁6份。
1.2試驗試劑
BHI培養(yǎng)基購自青島高科技海博生物技術(shù)有限公司；胎牛血清、牛血清白蛋白、卵磷脂購自浙江天杭生物科技股份有限公司；PBS、新潔爾滅、來蘇水、碘附、84消毒液、吐溫80、硫代硫酸鈉購自北京市慶盛達化工技術(shù)有限公司；瓊脂粉購自上海索萊寶科技有限公司；革蘭氏染液購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；革蘭氏陽性菌GP鑒定卡購自北京蘭伯瑞生物技術(shù)有限公司；無水乙醇購自北京慶盛達化工技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒購自天根生化科技有限公司。
1.3試驗儀器
SW-CJ-2FD潔凈工作臺購自上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HVA-85 Hirayama高壓滅菌器購自山東博科生物產(chǎn)品有限公司；48230V LabeyderPCR儀購自廣州市粵行儀器有限公司；ZHWY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器購自上海智城分析儀器制造有限公司；IS-RDV1立式單門雙層全溫振蕩器購自廣州市深華生物技術(shù)有限公司；VITEK2-compact30全自動微生物鑒定儀購自北京蘭伯瑞生物技術(shù)有限公司。
1.4試驗方法
1.4.1病原菌分離純化及生化鑒定
取臨床感染的驢和死亡驢肺部及頜下膿汁直接接種于含5%脫纖維羊血BHI培養(yǎng)基，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，挑取產(chǎn)生典型β溶血的菌落進行純化。
1.4.1.1革蘭氏染色
挑取鮮血培養(yǎng)基β溶血菌落，使用生理鹽水制成細(xì)菌懸液，進行革蘭氏染色。在油鏡下鏡檢，觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)和染色特性。
1.4.1.2生化鑒定
挑取純培養(yǎng)物，采用GP鑒定卡及VITEK2-compac全自動微生物鑒定系統(tǒng)進行生化反應(yīng)鑒定。
1.4.2seM測序鑒定
用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取分離株DNA，引物參考《馬腺疫檢疫技術(shù)規(guī)范》（SN/T 2977—2011）擴增馬鏈球菌馬亞種seM基因。F5′-CAGAAAACTAAGTGCCGGTG-3′，R5′-ATTCGGTAAGAGCTTGACGC-3′，由北京華大基因科技有限公司合成。PCR擴增體系（總體積為20μL）：Premix Taq10μL、DNA模板2μL、上游引物1μL、下游引物1μL、超純水6μL。PCR擴增程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性40 s，61.7℃退火40 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行擴增片段大小的確定，并進行回收測序。
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