1.2.3健康易感豬篩選
挑選無豬丹毒病流行史，未免疫過豬丹毒相關(guān)疫苗，基礎(chǔ)體溫不高于40℃，精神、采食、被毛、行動(dòng)均正常的56～63日齡豬30頭，采集全血，分離血清，采用競爭ELISA方法和《豬丹毒診斷技術(shù)》（NY/T 566—2019）中試管凝集方法同時(shí)進(jìn)行抗體檢測。
1.2.4 CVCC43005株對(duì)豬最小致死劑量測定
將CVCC43005株菌種用肉肝胃消化湯按照確定的培養(yǎng)條件制備成菌液；根據(jù)菌液預(yù)數(shù)結(jié)果，將菌液濃度通過稀釋或濃縮的方式調(diào)整為3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010CFU/mL后，靜脈注射56～63日齡健康易感豬；每個(gè)劑量組注射2頭豬，每頭豬注射5 mL；觀察4 d，記錄豬死亡情況，判定菌種毒力。
1.2.5不同凍干代次CVCC43005株菌種毒力檢定
將1986、1996、2006、2015年4個(gè)凍干代次的CVCC43005株菌種用肉肝胃消化湯按照確定的培養(yǎng)條件制備成菌液后，每個(gè)代次菌種靜脈注射56～63日齡健康易感豬2頭，每頭豬注射最小致死劑量，觀察4 d，記錄豬死亡情況。同時(shí)，每個(gè)代次菌種皮下注射18～22 g小鼠5只，每只小鼠注射10 CFU活菌，觀察7 d，記錄小鼠死亡情況。同時(shí)對(duì)菌液進(jìn)行復(fù)數(shù)，根據(jù)復(fù)數(shù)結(jié)果計(jì)算豬和小鼠實(shí)際注射的活菌數(shù)。
1.2.6不同凍干代次CVCC43005株菌種免疫原性檢定
用小鼠進(jìn)行免疫原性檢定。參照《規(guī)程》將1986、1996、2006、2015年4個(gè)凍干代次的CVCC43005株菌種分別制備成滅活抗原。取100只16～18 g小白鼠分為12組。第1～4組，每組10只，分別皮下注射4個(gè)凍干代次菌種制備的滅活抗原0.1 mL；第5～8組，每組10只，分別皮下注射4個(gè)凍干代次菌種制備的滅活抗原40%氫氧化鋁膠生理鹽水4倍稀釋液0.2 mL；第9～12組，每組5只，不注射疫苗，作為對(duì)照組。免疫21 d后，每個(gè)免疫組各取5只小鼠，連同對(duì)照組5只小鼠各注射1 000 MLD（Minimum Lethal Dose，最小致死量）CVCC43008強(qiáng)毒菌液，另取5只對(duì)照組小鼠注射1 MLD CVCC43008強(qiáng)毒菌液；每個(gè)免疫組剩余5只小鼠，連同對(duì)照組小鼠5只各注射1 000 MLD CVCC43006強(qiáng)毒菌液，另取5只對(duì)照組小鼠注射1 MLD CVCC43006強(qiáng)毒菌液。攻毒后觀察10 d，統(tǒng)計(jì)保護(hù)率。
2結(jié)果與分析
2.1 TSA培養(yǎng)基質(zhì)量評(píng)價(jià)
3瓶豬丹毒活疫苗活菌計(jì)數(shù)用參考品活菌計(jì)數(shù)結(jié)果分別為10.0×108、12.4×108、11.0×108CFU/頭份，均處于8.5×108～12.5×108CFU/頭份范圍內(nèi)，證明該批次TSA培養(yǎng)基適宜豬丹毒絲菌的生長。
2.2 CVCC43005株培養(yǎng)及制備工藝確定
豬丹毒絲菌CVCC43005株用肉肝胃消化湯培養(yǎng)24 h內(nèi)的活菌數(shù)結(jié)果見表1。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以活菌數(shù)對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，得出豬丹毒絲菌CVCC43005株用肉肝胃消化湯培養(yǎng)的生長曲線。結(jié)果（圖1）顯示，CVCC43005株在肉肝胃消化湯中培養(yǎng)16 h時(shí)活菌數(shù)最高，而后進(jìn)入穩(wěn)定期，培養(yǎng)19 h后活菌數(shù)迅速下降，菌體大量死亡。
圖1豬丹毒絲菌CVCC43005株生長曲線
表1 CVCC43005株活菌數(shù)結(jié)果
故確定豬丹毒絲菌CVCC43005株菌液制備工藝：將CVCC43005株凍干菌種用1.0 mL肉肝胃消化湯復(fù)溶后，取0.5 mL接種于含5%馬血清、0.2%綿羊裂解血細(xì)胞全血、0.4%葡萄糖的10.0 mL肉肝胃消化湯中，33℃靜置培養(yǎng)20 h；取新鮮菌液劃線接種于含10%馬血清、0.2%綿羊裂解血細(xì)胞全血的TSA平板，33℃培養(yǎng)42 h，作為一級(jí)種子；從一級(jí)種子上選取3個(gè)典型菌落接種于含5%馬血清、0.2%綿羊裂解血細(xì)胞全血、0.4%葡萄糖的10.0 mL肉肝胃消化湯（置于100 mL鹽水瓶）中，33℃120 r/min培養(yǎng)12 h，作為二級(jí)種子；取2.0 mL二級(jí)種子接種含5%馬血清、0.2%綿羊裂解血細(xì)胞全血、0.4%葡萄糖的100.0 mL肉肝胃消化湯（置于250 mL三角瓶）中，33℃120 r/min培養(yǎng)16 h收獲。
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